Получение нейронных предшественников из эмбриональных стволовых клеток мыши методом висячей капли

Аннотация

Источник: Hanafiah, A., et al. Дифференцировка и характеристика нейронных предшественников и нейронов из эмбриональных стволовых клеток мыши. J. Vis. Exp. (2020).

Видео демонстрирует дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши (mESCs) в эмбриоидные тельца (EB) методом висячей капли. После суспендирования мЭСК в висячих каплях и инкубации клетки агрегируются с образованием БЭ, которые в дальнейшем дифференцируются в нейрональные клетки-предшественники (NPC) с использованием дифференцировочной среды, дополненной ретиноевой кислотой (РА).

Протокол

1. Культура mESC

1. Смажьте 10-сантиметровую обработанную тканевой культурой пластину 0,1% желатина и дайте желатину застыть не менее 15–30 минут, прежде чем отсасывать его.
2. Семена γ облученные эмбриональные фибробласты мышей (МЭФ) за день до культивирования мЭСК в предварительно подогретой среде мЭСК (модифицированная среда Дульбекко Eagle (DMEM) с 15% фетальной бычьей сывороткой (FBS), заменимыми аминокислотами, β-меркаптоэтанолом, L-глутамином, пенициллином/стрептомицином, пируватом натрия, ингибиторным фактором лейкемии (LIF), PD0325901 (PD) и CHIR99021 (CH)).
3. Дайте облученным γ MEF осесть и прикрепиться к поверхности пластины перед культивированием клеток E14.
4. Разморозьте ЭСК Е14 на водяной бане при температуре 37 °C и быстро перенесите элементы в 15-сантиметровую коническую трубку с теплой средой mESC. Гранулируйте клетки при 200 х г в течение 3 минут и удалите надосадочную жидкость.
5. Ресуспендируйте клетки в 10 мл среды mESC и поместите клетки на культуральную пластину, содержащую ранее посеянные γ-облученные MEF. Инкубируйте культуру клеток в инкубаторе при температуре 37 °C при 5%_CO2.
6. Для пассирования культуры аспирируйте среду и промойте планшет стерильным 1x фосфатно-солевым буфером (PBS). Добавьте достаточно 0,05% трипсина, чтобы покрыть поверхность пластины, и выдерживайте при 37 °C в течение 3 минут.
7. Нейтрализуйте трипсин средой mESC и пипеткой для получения суспензии одиночных клеток. Центрифугируйте клетки при 200 х г в течение 3 мин и удалите надосадочную жидкость.
8. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток и засейте примерно 5,0 х^{10 5} клеток в культуральный планшет размером 10 см.
9. Ресуспендируйте клетки в 10 мл среды mESC, поместите клетки на покрытую желатином тканевую культуральную пластину и инкубируйте культуры, как описано ранее.
   заметка: Рекомендуется проводить мЭСК каждые 2 дня, чтобы предотвратить дифференцировку клеток в их колониях. Феноловый красный в среде действует исключительно как индикатор рН и в зависимости от плотности клеток, может стать желтоватым (более кислым), раньше, чем через 2 суток. Следовательно, может потребоваться менять среду каждый день. Облученные γ MEF в конечном итоге отмирают после пары проходов.

2. Дифференциация EB, NPC и нейронов

1. Выполните протокол бактериологического пассирования и подсчитайте количество клеток.
2. Метод висячих капель (день 0)
   1. Для 10-сантиметрового планшета для культивирования клеток подсчитайте примерно 2,5 x 10⁴ клеток, где 5,0 x 10² клеток будут суспендированы в среде для дифференцировки объемом 20 мкл (DMEM с 15% FBS, заменимые аминокислоты, β-меркаптоэтанол, L-глутамин, пенициллин/стрептомицин и пируват натрия). Примерно пятьдесят капель объемом 20 мкл, содержащих клетки, могут быть нанесены на одну 10-сантиметровую пластину.
   2. Выделите соответствующее количество клеток, а затем центрифугируйте клетки при 200 х г в течение 3 мин и удалите надосадочную жидкость.
   3. Ресуспендируют клетки в соответствующем объеме дифференцировочной среды для плотности клеток 5,0 x 10² клеток на 20 мкл (например, 2,5 x 10⁴ клеток в 1 мл дифференцировочной среды).
   4. С помощью микропипетки или пипетки-репитера поместите капли 20 мкл клеточной суспензии на крышку планшета для культуры тканей. Убедитесь, что капли не расположены слишком близко друг к другу, чтобы предотвратить их слияние.
      заметка: Капли могут быть нанесены либо на обработанную тканями, либо на подвесную пластину, поскольку они будут размещены на крышке, а не на самой пластине. Для более осуществимого и стерильного подхода поместите капли на планшет для культивирования тканей и перенесите их на планшет для суспензии, как описано ниже.
   5. Наполните тарелку 5–10 мл 1x PBS и осторожно закройте тарелку крышкой. Инкубируйте культуру в инкубаторе при температуре 37 °C.
      заметка: PBS добавляется в культуральную пластину, чтобы предотвратить высыхание капель.
3. На 2-й день с помощью микропипетки соберите капли с крышки и поместите их в 10-сантиметровую суспензию клеточной культуры, заполненную 10 мл дифференцировочной среды. Инкубируют культуру на орбитальном шейкере, встряхивая на малых оборотах в инкубаторе.
4. На 4-й день для сбора БЭ соберите клетки, центрифугируйте при 200 x g в течение 3 минут и удалите надосадочную жидкость.
   заметка: EB также можно промывать 1x PBS в соответствии с требованиями последующих экспериментов.
5. Чтобы продолжить процедуру и индуцировать дифференцировку БЭ в нейральные клетки-предшественники (NPC), приготовьте среду для дифференцировки с 5 мкМ ретиноевой кислотой (РА).
6. Удалите старую среду, гранулируя EB при 100 x g в течение 3 минут, или дайте EB осесть, прежде чем отсасывать старую среду. Добавьте в культуральный планшет 10 мл дифференцировочной среды, содержащей 5 мкМ РА.
7. На 6-й день замените не менее половины среды свежей средой, содержащей 5 мкМ РА, наклонив планшет и отпив среду, как описано выше><. заметка: Рекомендуется заменить не менее половины среды свежей средой, содержащей РА, на 5 и 7 день. Обратите внимание на красный индикатор фенола; Если он стал желтоватым, то лучше всего заменить всю среду.
8. На 8-й день соберите NPC, собрав клетки, центрифугируя при 200 x g в течение 3 минут и удалив надосадочную жидкость.
   заметка: NPC также могут быть промыты с помощью 1x PBS в соответствии с потребностями последующих экспериментов. При необходимости NPC могут быть заморожены и снова разморожены для последующего культивирования и анализа. Если NPC должны быть культивированы, аккутаза также может быть использована в качестве альтернативы трипсину.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,05% трипсин + 0,53 мМ ЭДТА 1X	Корнинг	25-052-СВ
0,1% желатина	сигма	Г1890-100Г	Приготовлено в деионизированной воде
CHIR99021	Кайман Кемикалс	13122
DMEM	Корнинг	10-017-СМ
Средний DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320033
EB-буфер	Цягэн	19086
этанол	111000200	Фармко	Разведенный в деионизированной воде
Фетальная бычья сыворотка	Атланта Биолакс	С10250
L-глютамин	Thermo Fisher Scientific	25030024
ЛИФ	Н/Д	Н/Д	Собрано из надосадочной жидкости MEF
MEM Заменимые аминокислоты	Корнинг	25-025-кл
PD0325901	Кайман Кемикалс	13034
Пенициллин/стрептомицин	Корнинг	30-002-Кл
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Н/Д	Н/Д	Приготовлено в деионизированной воде
Хлористый калий	П217-500Г	ВВР
Калий фосфат одноосновной безводный	0781-500Г	ВВР
Хлорид натрия	БП358-10	Биореагенты Фишера
Натрия фосфат, двухосновный, гептагидрат	СХ0715-1	Милипоре
Ретиноевая кислота	сигма	Р2625	Приготовлено в ДМСО
Пируват натрия	Корнинг	25-000-Кл
β-меркаптоэтанол	Биореагенты Фишера	БП176-100