$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Индукция нервных стволовых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от состояния клеток, примерно через 5 или 7 дней после трансфекции, однослойные адгезивные клетки достигнут 30 - 50% слияния (Рисунок 1C).
- Удалите надосадочную жидкость, содержащую плавающие клетки и сферы, а затем добавьте 1 мл нейропрогениторной среды (модифицированная орлиная среда Дульбекко: питательная смесь F-12 (DMEM/F12), содержащую 1x N2 добавку, 0,1% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1% (v/v) антибиотиков, 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF)) в адгезивные клетки.
- При необходимости диссоциируйте клеточные сферы путем осторожного пипетирования и центрифугирования клеток при 170 x g в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл нейропрогениторной среды в новой 24-луночной пластине, покрытой матригелем в соответствии с инструкцией в качестве резерва.
- Меняйте среду через день до тех пор, пока клетки не достигнут 60 - 80% сливаемости, обычно через 1 неделю.
- Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл среды нейральных стволовых клеток (среда без сыворотки, NSC SFM). Диссоциируйте клетки с помощью скребка для клеток с последующим очень аккуратным пипетированием.
- Удалите ячейки и засейте их все в одну лунку 6-луночного планшета. Добавьте еще 1 мл среды нейральных стволовых клеток, чтобы получилось по 2 мл среды для каждой лунки. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2.
- Меняйте носитель через день.
- Когда клетки достигают 60% конфлюенции, диссоциируйте и возвращайте клетки в соотношении 1:3, следуя шагам, описанным в 1,4 и 1,6.
