SiRNA-опосредованный сайленсинг генов в нервных стволовых клетках

Аннотация

Источник: Nguyen, B. H., et al. Культивирование и манипуляция клетками нервного гребня O9-1. J. Vis. Exp (2018)

Это видео демонстрирует использование малой интерферирующей РНК (миРНК) для подавления специфических генов, представляющих интерес в нейральных стволовых клетках, и их дифференцировки в желаемые типы клеток с использованием подходящей среды для дифференцировки. Эта процедура позволяет изучить критическую роль конкретных генов в процессе дифференцировки нейральных стволовых клеток.

Протокол

1. Манипуляции с клетками O9-1

1. Нокдаун миРНК в клетках O9-1
   1. Разморозьте и покройте 24-луночный планшет матрицей базальной мембраны перед началом эксперимента. Восстанавливайте и засеивайте клетки O9-1, позволяя им вырасти до конфлюенции от 60% до 80%.
   2. Развести липосомы в бессывороточных средах в соответствии с соответствующим объемом лунки. Разведите миРНК в бессывороточных средах до конечного результата. Добавляйте разведенную миРНК к разведенным липосомам в соотношении, рекомендованном производителем. Хорошо перемешайте с помощью пипетки, а затем инкубируйте.
      заметка: Следуйте руководству производителя по используемому объему, времени и температуре инкубации.
   3. Добавьте в клетки соответствующий объем миРНК-липидного комплекса в соответствии с рекомендациями производителя.
   4. Инкубируйте клетки в течение 24 ч в стандартном инкубаторе для клеточных культур (37 °C, 5%_CO2). Выполните последующие шаги по мере необходимости (экстрагируйте РНК, экстрагируйте белки, окрашивайте и т. д.)
      Примечание: время нокдауна и концентрации миРНК могут варьироваться в зависимости от конкретного эксперимента.

2. Дифференцировка клеток O9-1

1. Дифференцировка клеток O9-1 в остеобласты
   1. Для приготовления остеогенных сред для дифференцировки разбавляют в альфа-МЭМ (указаны конечные концентрации): 0,1 мкМ дексаметазона, 100 нг/мл костного морфогенетического белка 2 (BMP2), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10 мМ b-глицерофосфата, 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
   2. Определите маркер остеобластов, остеокальцин, у дифференцированных остеобластов с помощью иммуноокрашивания, как показано на рисунке 1.
      Остеогенная дифференцировка также может быть оценена с помощью других маркеров остеобластов или с помощью окрашивания ализарином в красный цвет или щелочной фосфатазы.
2. Дифференцировка клеток O9-1 в гладкомышечные клетки
   1. Для приготовления сред для дифференцировки гладкомышечных клеток разведите в DMEM (указаны конечные концентрации): 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% FBS.
   2. Оценивает дифференцировку гладкомышечных клеток с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител против маркеров гладкомышечных клеток, таких как гладкомышечный актин (СМА), показанный в качестве примера на рисунке 2.

Результаты

Рисунок 1: Иммунофлуоресцентное окрашивание остеобластного маркера остеокальцина (Ocn), указывающее на то, что клетки O9-1 дают начало клеткам остеобластов в условиях остеогенной дифференцировки. Клетки окрашивали антителом к маркеру остеобластов Ocn (зеленым цветом), а ядра окрашивали DAPI (синим). Стрелками обозначены Ocn-положительные клетки. Остеокальцин (Ocn, маркер остеобластов...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
O9-1 клеточная линия черепного нервного гребня мыши	Миллипора Сигма	СКК049
DMEM, высокий уровень глюкозы, без глютамина	Gibco	11960-044
ДМЭМ, высокий уровень глюкозы	Гиклон	SH30243.01
FBS (фетальная бычья сыворотка)	Миллипора Сигма	ЕС-009-Б
Пенициллин – стрептомицин	Gibco	15140-122
L-глютамин 200 мМ (100X)	Gibco	No 25030-081
Трипсин-ЭДТА 0,25% в HBSS	Дженеси Сайентиал	25-510
DPBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко) без кальция и магния	Лонза	17-512Ф
Заменимые аминокислоты MEM (MEM NEAA) 100X	Gibco	11140-050
Пируват натрия (100 мМ)	Gibco	11360-070 (Английский)
2-Меркаптоэтанол	сигма	М-7522
Фактор роста фибробластов человека рекомбинантный основной (rhFGF-базовый)	Системы НИОКР	233-ФБ-025
Митомицин С	Рош	10107409001
Матрица Matrigel	Корнинг	356234
ДМСО (диметилсульфоксид)	Миллипора Сигма	МХ1458-6
Липофектамин РНКиМАКС	Thermo Fisher Scientific	13778-075
Opti-MEM I (1X)	Gibco	31985-070 (Английский)
Минимально незаменимая среда, альфа-1X с солями Эрла, рибонуклеозидами, дезоксирибонуклеозидами и L-глутамином	Корнинг	10-022-КВ
ON-TARGETplus Wwtr1 миРНК	Дхармакон	Л-041057
ON-TARGETplus Нецелевой пул	Дхармакон	Д-001810
ON-TARGETplus Yap1 миРНК	Дхармакон	Л-046247
FCS (сыворотка для телят плода)
ИТС (инсулин-трансферрин-селен)
ТГФ-Б3
аскорбиновая кислота
BMP2 (костный морфогенетический белок 2)
Дексаметазон
Добавка к B-27

гг.