Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Выделение предполагаемых индуцированных колоний нейронных клеток-предшественников (iNPC)
- За день до сбора колоний iNPC покройте одну 48-луночную пластину ламинином: разведите ламинин до 1 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS), добавьте 300 мкл раствора на планшеты и выдерживайте при температуре 4 °C в течение 24 часов. Через день аспирируйте ламинин из планшетов и добавьте в лунки 200 мкл нейроиндукционной среды (1:1 DMEM/F-12:Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 нг/мл ингибиторного фактора лейкемии человека, 3 мкМ CHIR99021, 2 мкМ SB431542).
- Вымойте 6-луночные планшеты, содержащие колонии, которые должны быть собраны один раз, DPBS и добавьте 2 мл нейроиндукционной среды на лунку 6-луночной пластины. Подбирайте колонии механическим способом: соскребите колонии с помощью тонкой иглы, чтобы избавиться от окружающих клеток; Установите пипетку объемом 200 мкл на 50 мкл и выберите колонии с помощью соответствующих наконечников для дозатора.
- Перенесите по одной колонии в одну лунку покрытой ламинином 48-луночной пластины и механически сгенерируйте одноклеточную суспензию путем пипетирования вверх и вниз 10 раз. Добавьте в клетки ингибитор ROCK Y27632 в конечной концентрации 10 мкМ.
- Выращивайте клетки на 48 лунке при 37 °C, 5%CO2 в течение 2 дней. Меняйте среду каждые два дня до тех пор, пока клетки не достигнут 80 - 90% конфлюенции (прибл. 3 - 4 дня).
