$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка 24-луночных планшетов для культур нейронов высокой плотности
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги (2-3) за день до запланированного сбора эмбрионов.
- Поместите два 24-луночных планшета в колпак для клеточных культур и откройте индивидуальную упаковку.
- Подсоедините иглу шприца 18 г к пластиковому одноразовому шприцу объемом 1 мл.
- Держите шприц и направьте кончик иглы на ~1 мм влево к центру дна лунки. Приложите умеренное усилие (~250 г), чтобы протравить дно лунки (длиной ~1 мм). Будет сформирована канавка, а смещенные пластиковые материалы образуют приподнятую опору над плоской поверхностью дна. Аналогичным образом вытравить еще одну параллельную канавку длиной ~1 мм на расстоянии ~1 мм справа от центра дна.
- Повторите этот шаг для всех лунок двух 24-луночных планшетов. Два 24-луночных планшета, используемые для культивирования с высокой плотностью, теперь готовы к покрытию поли-D-лизином (см. шаг 2.8 ниже).
2. Подготовка покровных стекол для культур нейронов низкой плотности
- Используйте круглое стекло диаметром 12 мм #1.
- Поместите 50 покровных колпачков в стерильную пластиковую чашку Петри диаметром 100 мм и погрузите покровные стекла в 20 мл 70% раствора этанола. Поместите эту чашку Петри на вращающуюся платформу с умеренной (70 оборотов в минуту) скоростью вращения на час. Удалите 70% этанола, а затем замените его свежей партией 70% этанола. Переверните и постирайте еще час.
- Выбросьте 70% раствор для чистки этанолом. Добавьте стерильную воду (отфильтрованную через фильтрующую установку 0,2 мкм). Тщательно промойте покровные стекла, вращая чашку Петри вручную. Промыть три раза, каждый раз заменяя свежей стерильной водой.
- Поместите чашку Петри с покровными стеклами внутрь стерильного колпака для клеточных культур с ламинарным потоком. Отсадите воду для промывки через вакуумную линию и добавьте 10 мл фильтрованной стерильной воды, чтобы погрузить покровные стекла. Покровные стекла должны быть стерильными, а поверхность – достаточно чистой для нанесения поли-D-лизинового покрытия.
- Откройте две 24-луночные пластины из индивидуальной упаковки и поместите их в колпак.
- Включите вакуумную линию в вытяжке. Подсоедините наконечник для дозатора объемом 200 мкл к вакуумной линии и с помощью ножниц отрежьте наконечник, чтобы создать большее отверстие.
- Используйте пинцет с тонким наконечником #5, чтобы собирать покровные листы из чашки Петри, по одному, и используйте вакуумную линию, чтобы полностью высушить покровное покрытие. Затем поместите по одному покровному стеклу в каждую из лунок 24-луночной пластины. 50 очищенных покровных стекол должно быть достаточно, чтобы заполнить каждую из лунок двух 24-луночных планшетов.
- Развести стоковый раствор поли-D-лизина (1 мг/мл) в рабочем растворе (0,1 мг/мл) с боратным буфером (pH 8,5). Для четырех 24-луночных планшетов (включая два планшета высокой плотности с протравленным дном) приготовьте 30 мл общего рабочего раствора.
- Добавьте 300 мкл 0,1 мг/мл рабочего раствора поли-D-лизина в каждую лунку со стеклянными покровными стеклами. Убедитесь, что покровные стекла полностью погружены в раствор. Если нет, используйте наконечник пинцета #5, чтобы прижать покровные стекла к дну колодца, и используйте наконечник, чтобы направить раствор поли-D-лизина, чтобы покрыть всю поверхность покровных стекол. Визуально осмотрите все покровные стекла, чтобы убедиться, что между пластиной и покровными стеклами не застрял воздух.
- Добавьте 300 мкл 0,1 мг/мл рабочего раствора поли-D-лизина в каждую лунку культурального планшета высокой плотности с протравленным дном. Вращайте вручную, чтобы распределить раствор по всему дну лунки.
- Верните все четыре планшета с поли-D-лизином в инкубатор для культур и инкубируйте О/Н.
3. Мойка и предварительное кондиционирование тарелок для культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги (3-5) выполняются в день забора ткани.
- После инкубации/нанесения покрытия на покровные стекла и 24-луночные планшеты O/N поместите все четыре планшета (два с донорскими покровными стеклами, два акцепторных планшета высокой плотности с травленым пластиковым дном) в культуральный колпак. Используйте вакуумную линию для удаления раствора поли-D-лизина.
- Сразу после удаления раствора поли-D-лизина добавьте ~1 мл стерильной воды в каждую лунку с помощью пластиковой переводной пипетки. После того как все лунки будут заполнены водой, дать постоять 10 минут. Удалите воду с помощью вакуума, затем добавьте 300 мкл промывочной среды в каждую лунку, чтобы покрыть дно лунки (со стеклянными покровными стеклами или без них). Не допускайте пересыхания поли-D-лизинового покрытия.
- Верните все четыре пластины в камерный инкубатор. Пластины готовы к использованию после того, как дисперсные нейроны гиппокампа будут подготовлены.
4. Покрытие нейронов и долгосрочная кокультура
- Поместите два 24-луночных планшета с травленым дном для нейронов высокой плотности в колпак для клеточных культур. Удалите среду предварительного кондиционирования объемом 300 мкл с помощью вакуума. Планшет 0,6 мл клеточных суспензий высокой плотности со скоростью 250 000 нейрон/мл.
- Поместите два других 24-луночных планшета с покровными крышками в культуральный колпак и извлеките 300 мкл предварительно кондиционированной среды с помощью вакуума. Планшет 0,6 мл клеточных суспензий низкой плотности со скоростью 10 000 нейрон/мл на покровных стеклах внутри двух 24-луночных планшетов.
- Верните все четыре 24-луночные планшета в инкубатор. Оставьте на 2 часа.
- Переверните покровные стекла низкой плотности с прилипшими нейронами к культуре высокой плотности. Убедитесь, что нейроны обращены друг к другу (т.е. не разделены стеклянной крышкой). Затем верните две тарелки с сокультурой в инкубатор.
5. Поддержание совместной культуры
- Скармливайте сокультурам, добавляя 300 мкл свежей кормовой среды (см. раздел «Материалы») в день in vitro (DIV) 5. Нет необходимости удалять 50% исходной полной питательной среды, как сообщается во многих других исследованиях. Питательная среда также содержит 15 мкМ цитозина арабинозида (Ara-C, с получением конечной концентрации 5 мкМ) для минимизации вероятности загрязнения и пролиферации глии.
- После этого первоначального кормления каждую неделю добавляйте в лунку 300 μл свежей кормовой среды без Ara-C. Если культура хранится более одного месяца, заменяйте половину среды свежей кормовой средой каждую неделю по истечении одного месяца (с первой половинной заменой среды в DIV33). Морфологически нейроны как высокой, так и низкой плотности выглядят здоровыми до трех месяцев (самый долгий срок, наблюдаемый экспериментаторами).