Дифференцировка клеточной линии нейробластомы человека в зрелые нейроны

Аннотация

Источник: Shipley, M. M., et al. Дифференцировка клеточной линии нейробластомы человека SH-SY5Y. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует технику преобразования недифференцированных клеток нейробластомы SH-SY5Y в полностью дифференцированные зрелые нейроны с использованием метода систематического пассирования. Это включает в себя культивирование клеток в ряде сред с постепенно снижающимся уровнем в сыворотке крови, чтобы подавить пролиферацию эпителиальноподобных клеток, способствуя дифференцировке и пролиферации нейроноподобных клеток. Кроме того, среда дополнена ретиноевой кислотой и специфическими факторами роста, которые индуцируют терминальную дифференцировку нейроноподобных клеток в зрелые нейроны, демонстрирующие обширную разветвленную морфологию.

Протокол

1. Общие соображения

1. Список необходимых реагентов см. в Таблице материалов/оборудования. Выполняйте все этапы в строгих асептических условиях.
2. Используйте термоинактивированную фетальную бычью сыворотку (hiFBS) для всех препаратов среды, которые включают FBS. Для нагревания необходимо нагреть 50 мл аликвоты FBS при температуре 56 °C в течение 30 минут, переворачивая каждые 10 минут (см. также Таблицу 1).
   заметка: Когда FBS используется без тепловой инактивации, эпителиальноподобный фенотип прогрессирует быстрее во всех культурах клеток SH-SY5Y.
3. Перед использованием дайте среде нагреться и сбалансироваться в инкубаторе, чтобы установить надлежащий баланс pH перед каждым шагом. Например, для полного равновесия 50 мл среды требуется примерно один час (pH 7, 37 °C, 5% CO₂).
   заметка: В этом протоколе используется двухступенчатая процедура расщепления, которая требует трипсинизации и повторной пластинации частично дифференцированных клеток SH-SY5Y. Это стрессовый процесс для этих исключительно хрупких клеток. Поэтому важно инкубировать клетки в трипсине в течение минимального количества времени. Это обеспечит преимущественный подъем нейронов, оставляя эпителиальные клетки все еще прикрепленными к чашке.
4. Медленно выполняйте тритурацию дифференцированных клеток с помощью пластиковой пипетки объемом 10 мл, кончиком которой следует прижать дно конической трубки, содержащей клетки. Выполняйте растирание с медленной скоростью, вверх и вниз не более пяти раз.
   

2. Размораживание и культивирование недифференцированных клеток нейробластомы SH-SY5Y

1. Подготовьте основные питательные среды.
2. Быстро разморозьте замороженные клетки на водяной бане при температуре 37 °C (примерно 2 минуты).
3. Ресуспендируйте клетки в 9 мл основной питательной среды в конической пробирке объемом 15 мл, а затем центрифугируйте в течение 2 мин при 1000 x g.
4. Аспирируйте надосадочную жидкость, стараясь не повредить гранулированные клетки, и мягко ресуспендируйте клетки в 10 мл основной питательной среды.
5. Пластинчатые ячейки на колбу Т-25 или 60 мм² тарелки.
6. На следующий день замените носители для удаления омертвевших клеток.

3. День 0: Покрытие клеток для дифференцировки

1. График дифференцировки показан на рисунке 1.
2. Промойте недифференцированные клетки 1x PBS, аспирируйте, а затем трипсинизируйте с помощью 1-2 мл подогретого 1x 0,05% Trypsin-EDTA.
3. Когда клетки окажутся в трипсине, инкубируйте в инкубаторе в течение примерно 3 минут.
4. Утолите трипсин, добавив 10 мл основной питательной среды, промойте стенки колбы или посуды и слегка разрастите 1-3 раза. Переложите содержимое в коническую пробирку объемом 15 мл.
5. Центрифугируйте в течение 2 минут при давлении 1 000 x g и отсасывайте среду, стараясь не повредить гранулу.
6. Суспендируйте гранулы в 5 мл основной питательной среды и растирайте 1-3 раза.
7. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, затем разбавьте с помощью основной питательной среды до 50 000 клеток/мл.
8. Тарелка 2 мл клеток на 35 мм² чашки, всего 100 000 клеток на чашку и поместите обратно в инкубатор.

4. День 1: Смена медиа (Дифференциация медиа #1)

1. Аликвоту 50 мл дифференцировочной среды #1 (см. Таблицу 2) и инкубировать на водяной бане при температуре 37 °C.
2. Когда среда нагрета, дайте ей сбалансироваться в инкубаторе (37 °C, 5%_CO2) в течение как минимум одного часа, чтобы установить надлежащий баланс pH перед использованием.
3. Добавляйте ретиноевую кислоту (RA) (см. Таблицу 1) в подогретую и сбалансированную среду непосредственно перед добавлением среды в посуду.
   заметка: Ретиноевая кислота светочувствительна и должна храниться в темных бутылках при температуре 4 °C
4. Аккуратно отсасывайте старый средний материал и выбросьте.
5. Добавьте 2 мл дифференцировочной среды #1 с RA на чашку 35^мм2 и верните в инкубатор.

5. День 3: Смена медиа (Дифференциация медиа #1)

1. Повторите раздел 4 (шаги 1-5)

6. День 5: Смена медиа (Дифференциация медиа #1)

1. Повторите раздел 4 (шаги 1-5)

7. День 7: Разделенные ячейки 1:1

1. Добавляйте РА в подогретый и сбалансированный фильтрующий материал #1 непосредственно перед добавлением фильтрующего материала в блюда.
2. Аккуратно отсасывайте старый средний материал и выбросьте.
3. Добавьте 200 мкл подогретого 0,05% трипсина ЭДТА 1x Трипсина ЭДТА на чашку 35^мм2 и прогревайте в инкубаторе примерно 2-3 минуты или до тех пор, пока клетки не будут заметно подняты с тарелки, как это видно под микроскопом.
4. Утолите трипсин, добавив 2 мл дифференцировочной среды #1 с RA на чашку 35^мм2 и используйте эту среду для смывания оставшихся нейрональных клеток с тарелки. Затем переложите содержимое в коническую пробирку объемом 50 мл.
   заметка: Не трипсинизируйте слишком много блюд одновременно на этапах трипсинизации. Это помогает гарантировать, что культуры нейронов не инкубируются в трипсине слишком долго, что может быть цитотоксичным.
5. Смешайте содержимое до 10 тарелок в конической пробирке объемом 50 мл и осторожно растирайте вверх и вниз не более пяти раз с помощью пластиковой пипетки объемом 10 мл.
6. Аликвот 2 мл клеточной суспензии в свежие 35 мм 2 посуды и вернуть в инкубатор.

8. День 8: Смена медиа (Дифференциация медиа #2)

1. Добавляйте РА (см. Таблицу 1) в подогретые и сбалансированные среды непосредственно перед добавлением среды в блюда.
2. Аккуратно отсасывайте старый средний материал и выбросьте.
3. Медленно добавьте 2 мл дифференцировочной среды #2 (см. Таблицу 2) с RA на чашку 35^мм2 и верните в инкубатор. Не позволяйте нейронам подвергаться воздействию воздуха в течение длительного периода времени, так как они могут быстро высохнуть.

9. День 9: Готовим блюда, покрытые внеклеточным матриксом (ECM)

1. Разморозьте один флакон раствора ECM на льду и разведите 1:100 в холодном DMEM.
2. Выдавите по 2 мл смеси в каждую форму диаметром 35^мм2 и убедитесь, что все основание формы покрыто.
3. Поместите в инкубатор (37 °C, 5%_CO2) на 1 час или на ночь.
4. Асасируйте смесь и дайте высохнуть на воздухе в течение примерно 1 часа в вытяжке. Хранить при комнатной температуре до 2 месяцев.

10. День 10: Перенос ячеек на пластины с покрытием ECM 1:1

1. Добавляйте РА (см. Таблицу 1) в подогретые и сбалансированные среды непосредственно перед добавлением среды в блюда.
2. Аккуратно отсасывайте от среды и выбросьте.
3. Добавьте 200 мкл подогретого трипсина в каждую чашку диаметром 35^мм2 и дайте инкубироваться при комнатной температуре в течение примерно 1-2 минут или до тех пор, пока нейроны не будут заметно подняты из чашки><, как это видно под микроскопом. заметка: Выполняйте этот этап трипсинизации при комнатной температуре, чтобы избежать чрезмерной инкубации нейронов трипсином и причинения вреда. На этой стадии нейроны высвобождаются из пластин гораздо быстрее, чем эпителиальноподобные клетки.
4. Утолите трипсин, добавив 2 мл дифференцировочной среды #2 на чашку 35^мм2, и используйте эту среду для смывания оставшихся нейрональных клеток с пластины. Затем переложите содержимое в коническую пробирку объемом 50 мл.
5. Смешайте содержимое до 10 тарелок в конической пробирке объемом 50 мл и осторожно растирайте вверх и вниз не более пяти раз с помощью пластиковой пипетки объемом 10 мл.
6. Дозируйте 2 мл клеточной суспензии в 2 чашки с покрытием ECM 35 мм 2 и верните в инкубатор.

11. День 11: Смена медиа (Дифференциация медиа #3)

1. Добавляйте РА (см. Таблицу 1) в подогретые и сбалансированные среды непосредственно перед добавлением среды в блюда.
2. Аккуратно отсасывайте старый средний материал и выбросьте.
3. Медленно добавьте 2 мл дифференцировочной среды #3 (см. Таблицу 2) с RA на чашку 35^мм2 и верните в инкубатор. Не допускайте воздействия воздуха на нейроны в течение длительного периода времени.

12. День 14: Смена медиа (Дифференциация медиа #3)

1. Повторите раздел 11 (шаги 1-3)

13. День 17: Последнее изменение медиа (Дифференциация медиа #3)

1. Повторите раздел 11 (шаги 1-3)

14. День 18: Культуры нейронов готовы к использованию

1. Меняйте среду на свежую среду для дифференцировки #3 с РА каждые 3 дня для поддержания здоровья нейронов.
   заметка: Клетки должны быть дифференцированы в нейроны и проявлять нейронный фенотип. Культуры обычно стабильны в течение 14 дней после терминальной дифференцировки. Однако продолжительность жизнеспособности нейронов зависит от числа проходов недифференцированных клеток в начале дифференцировки. Более высокое число пассажей дает дифференцированные нейроны с более коротким сроком службы.

Таблица 1: Стоковые решения и компоненты.

компонент	подробности	запас	резолюция
10 μM RA	Полностью транс-ретиноевая кислота	5 mM	Ресуспендировать 50 мг РА в 33,3 мл 95% EtOH. РА чувствителен к теплу, свету и воздуху. Хранить в темной бутылке при температуре 4 °C до 6 недель. Используйте при разведении 1:500 и разбавьте в дифференцировочной среде непосредственно перед использованием
	(300,44 г/моль)
1х Б-27	Дополнение к B-27	В 50 раз	Разморозьте флакон объемом 1-10 мл и остатки аликвоты в одноразовые бутылки по 1 мл и храните при температуре -80°C. Флаконы объемом 10 мл храните при температуре -20°C
20 mM KCl	Хлористый калий	1 М	Добавьте 250 мл воды к 18,6 г KCl и стерильный фильтр. Хранить при комнатной температуре
	(74,55 г/моль)
2 mM db-cAMP	дибутирилциклический АМФ	1 М	Суспендируйте полную бутылку, добавив 2,04 мл воды к 1 г db-cAMP. Чувствителен к свету и влаге. Хранить в аликвотах объемом 100 μл или 200 μл при -20 °C или -80 °C
	(491,37 г/моль)
50 нг/мл BDNF	Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF)	- T	Пробирка центрифуги для получения порошка на дно. Ресуспендируйте флакон 10 мкг в 1 мл Neurobasal + 1x B27 или 5 мкг флакон в 0,5 мл Neurobasal + 1x B27, чтобы получить 10 мкг/мл. Используйте при разведении 1:200. Хранить рабочие аликвоты при температуре -80 °C (например: 250 μл)
hiFBS	Термоинактивированная фетальная сыворотка крупного рогатого скота	- T	Аликвот разморозил FBS в конические пробирки по 50 мл. Нагревать до 56 °C на водяной бане в течение 30 минут. Снимите и заморозьте рабочие аликвоты при -20 °C

Таблица 2: Медиа-рецепты.

Основные среды для роста
компонент	Объем на 500 мл	разбавление
ЭМЕМ	415 мл EMEM
15% hiFBS	75 мл hiFBS
1x Ручка/Стрептококк	5 мл Pen/Strep	1:100
2 мМ глютамина	5 мл глютамина	1:100
*Хранить максимум 6 недель
Средства дифференциации #1
компонент	Объем на 50 мл	разбавление
ЭМЕМ	48 мл EMEM
2,5% hiFBS	1,3 мл hiFBS
1x Ручка/Стрептококк	500 μл Pen/Strep	1:100
2 мМ глютамина	500 мкл глютамина	1:100
10 мкМ РА	100 μл RA (5mM stock)	1:500
*Хранить максимум 2 недели и добавить RA непосредственно перед использованием
*Не сохраняйте лишние носители после добавления RA - RA нестабилен
Средства дифференциации #2
компонент	Объем на 50 мл	разбавление
ЭМЕМ	49 мл EMEM
1% hiFBS	500 мкл hiFBS
1x Ручка/Стрептококк	500 μл Pen/Strep	1:100
2 мМ глютамина	500 мкл глютамина	1:100
10 мкМ РА	100 μл RA (5mM stock)	1:500
*Хранить максимум 2 недели и добавить RA непосредственно перед использованием
*Не сохраняйте лишние носители после добавления RA - RA нестабилен
Средства дифференциации #3
компонент	Объем на 50 мл	разбавление
Нейробазальный	47 мл Нейробазал
1х Б-27	1 мл B-27 (50X stock)	1:50
20 мМ KCl	1 мл KCl (1М бульон)	1:50
1x Ручка/Стрептококк	500 μл Pen/Strep	1:100
2 мМ ГлутамаксI	500 мкл GlutamaxI (100x стоковый)	1:100
50 нг/мл BDNF	250 μл BDNF stock (10 μг/мл)	1:200
2 мМ дибутирилциклический АМФ (db-cAMP)	100 мкл db-cAMP (1М склада)	1:500
10 мкМ РА	100 μл RA (5 мМ стоковых)	1:500
*Хранить максимум 2 недели и добавить RA непосредственно перед использованием
*Не сохраняйте лишние носители после добавления RA - RA нестабилен

Результаты

Рисунок 1: График процедуры дифференциации. Процесс дифференциации состоит из 11 этапов, распределенных в течение 18-дневного периода. В первый день протокола дифференцировки (день 0) от 25 000 до 100 000 клеток наносятся на непокрытые 35-миллиметровые чашки. В дни 1, 3 и 5 старые носители удаляются и применяется среда для дифференцировки #1. На 7-й день клетки расщепляются в соотношении 1:1 на 35-ми...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
В-27	ThermoFisher Scientific	17504-044	Подготовка приведена в таблице 1
Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF)	сигма	SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg)	Подготовка приведена в таблице 1
дибутирилциклический АМФ (db-cAMP)	сигма	Д0627	Подготовка приведена в таблице 1
Дмсо	АТКС	4-х	- T
Минимальные необходимые средние орлы (EMEM)	сигма	М5650	- T
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Гиклон	SH30071.03	Подготовка приведена в таблице 1
ГлутамаксI	Технологии Life	35050-061 (Английский)	- T
глутамин	Гиклон	SH30034.01	- T
Хлорид калия (KCl)	Научный центр Фишера	БП366-1	Подготовка приведена в таблице 1
Решение MaxGel для лечения внеклеточного матрикса (ECM)	сигма	Е0282	Смотрите шаг 11 протокола
Нейробазальный	Технологии Life	No 21103-049	- T
Пенициллин/стрептомицин (Pen/Strepp)	Технологии Life	15140-122	- T
Ретиноевая кислота (РА)	сигма	Р2625	Следует хранить в темноте при температуре 4 °C, так как этот реагент чувствителен к свету
Клетки SH-SY5Y	АТКС	ЦРЛ-2266	- T
0,5% Трипсин + ЭДТА	Технологии Life	15400-054	- T
Тарелки Falcon 35 мм TC	Falcon (бренд Corning)	353001	- T