Методика получения нейральных клеток-предшественников из эмбриональных стволовых клеток мыши

Аннотация

Источник: Мао, Х., и др. Дифференцировка нейронов из эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует метод создания in vitro нейронных клеток-предшественников (NPC) из эмбриональных стволовых клеток мыши (mESCs). mESCs культивируют в суспензии с образованием эмбриоидных телец (EB), которые затем дифференцируются в NPC с помощью обработки ретиноевой кислотой в адгезивной культуре.

Протокол

1. Культура эмбриональных стволовых клеток мыши

1. Приготовьте чашки или тарелки для клеточных культур, покрытых 0,1% желатином.
   1. Добавьте 2 мл стерилизованного 0,1% желатина (0,1% по массе в воде) в чашки для клеточных культур диаметром 60 мм. Осторожно покачивайте, чтобы обеспечить равномерное покрытие чашек для клеточной культуры.
   2. Поместите посуду в инкубатор с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C и оставьте на 1 час.
   3. Удалите 0,1% раствор желатина перед затравливанием клеток.
      заметка: После удаления желатина нет необходимости сушить или мыть покрытую покрытием посуду.
2. Культура эмбриональных стволовых клеток мыши (A2lox и 129)
   1. Инкубируйте клетки mESCs (A2lox и 129) в чашках для культуры 60 мм, покрытых желатином, покрытых желатином, в питательной среде mESC при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 соответственно. Питательная среда mESC на 85% состоит из модифицированной Dulbecco модифицированной смеси Eagle medium/питательных веществ F-12 (DMEM/F12), 15% нокаутирующей заменительной сыворотки (KSR), 0,1 мМ β-меркаптоэтанола (2ME), 2 мМ GlutaMAX, 1% заменимой аминокислоты (NEAA), 1% пенициллина/стрептомицина (P/S), 1000 Ед/мл ингибиторного фактора лейкемии (LIF), 10 нМ CHIR-99021 (ингибитор GSK-3) и 0,33 нМ PD0325901 (ингибитор MEK).
      ВНИМАНИЕ: β-меркаптоэтанол легко воспламеняется и обладает ингаляционной токсичностью. Держите вдали от источников огня и надевайте маску, чтобы избежать вдыхания при использовании.
   2. Ежедневно меняйте питательную среду mESC для лучшего роста A2lox и 129.
   3. Когда клетки достигнут 80% слияния, удалите среду и добавьте в чашку 1 мл 0,1% трипсина. Осторожно покачивайте в течение 30 с, чтобы обеспечить равномерное покрытие трипсином всех клеток.
   4. Оставьте клетки примерно на 1 минуту для трипсинизации, а затем удалите трипсин с помощью пипетки объемом 1 мл.
   5. Добавьте 2 мл питательной среды mESC в чашку, пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы получить одноклеточную суспензию.
   6. Посчитайте плотность клеток в суспензии как можно точнее с помощью гемоцитометра.
   7. Разделите клетки на 7 групп и индуцируйте дифференцировку, используя различные протоколы, показанные в таблице 1.

2. Дифференциация mESC и NPC

1. Приготовьте планшеты для клеточных культур, покрытые 0,1% желатином, или покровные стекла.
   1. Перед использованием приготовьте покрытые 0,1% желатином 6-луночные планшеты или покровные стекла, как показано в шаге 1.1.
2. Дифференциация (Таблица 1)
   1. Добавьте 1,5 x 10⁶ mESCs в неадгезивную бактериальную чашку в 10 мл базальной дифференцировочной среды I, чтобы обеспечить образование эмбриоидного тела при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2.
   2. Через 2 дня переложите клеточные агрегаты в центрифужные пробирки объемом 15 мл и дайте им осесть под действием силы тяжести.
   3. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 10 мл свежей среды базальной дифференцировки I для ресуспендирования эмбриоидных телец. Пересадите их в новую неадгезивную бактериальную посуду и дайте дифференцировке еще 2 дня.
   4. Проверьте формирование эмбриоидных телец под микроскопом (рисунок 1А).
   5. Соберите эмбриоидные тельца, как описано в шагах 2.2.2-2.2.3. Высадите около 50 эмбриоидных тел в 2 мл базальной дифференцировочной среды I на лунку на 0,1% покрытые желатином 6-луночные планшеты.
   6. Приготовьте запас 1 мМ полностью транс-ретиноевой кислоты (RA) (в ДМСО) и храните вдали от света в морозильной камере при температуре -80 °C после подупаковки><. заметка: РА нестабилен, поэтому следует обратить внимание на то, чтобы держать его вдали от света и уменьшить контакт воздуха во время приготовления поголовья РА.
   7. Для индукции РА добавьте 2 мкл запаса РА в каждую лунку, чтобы получить конечную концентрацию 1 мкМ.
   8. Поместите планшет в инкубатор с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C и дифференцируйте еще на 4 дня.
   9. Меняйте все 2 мл среды базальной дифференцировки I (с 1 мкМ РА) каждые 2 дня.

Таблица 1: Подробная информация о протоколе, используемом при дифференциации.

протокол	медиа
4-дневное формирование эмбриоидных тел + 4-дневная индукция РА	Базальная дифференцировочная среда: DMEM/F12 +15% FBS + 1% NEAA+0,1 мМ 2ME+ 1% P/S

Результаты

Рисунок 1: Морфология эмбриоидных тел. (А) Эмбриоидные тельца культивируются в течение 4 дней. (Б) Эмбриоидные тельца культивируются в течение 2 дней.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Добавка B-27 (50X), без сыворотки	Gibco	17504044	хранить при температуре -20 °C, и беречь от света
ЧИР-99021 (CT99021)	Селлек	С1263	хранить при -20 °C
Покровные стекла	гнездо	801007
Фетальная бычья сыворотка	ГиКлон	SH30084.03	хранить при -20 °С, не допускать многократной заморозки и размораживания
желатин	Gibco	CM0635B	Хранить при комнатной температуре
Добавка GlutaMAX	Gibco	35050061	хранить при температуре 4 °C
Нокаут DMEM/F-12	Gibco	12660012	хранить при температуре 4 °C
Замена сыворотки KnockOut	Gibco	10828028	хранить при -20 °С, не допускать многократной заморозки и размораживания
MEM Раствор заменимых аминокислот	Gibco	11140076	хранить при температуре 4 °C
Добавка N-2 (100X)	Gibco	17502048	хранить при температуре -20 °C и беречь от света
Нейробазальная среда	Gibco	21103049	хранить при температуре 4 °C
Фосфатно-солевой буфер (1X)	ГиКлон	SH30256.01B	хранить при температуре 4 °C
Раствор пенициллина/стрептомицина	ГиКлон	SV30010	хранить при температуре 4 °C
PD0325901(Мирдаметиниб)	Селлек	С1036	хранить при -20 °C
Ретиноевая кислота	сигма	Р2625	хранить при температуре -80 °C и беречь от света
Штамм 129 Эмбриональные стволовые клетки мыши	Циаген	МУАЭС-01001	Поддерживается в системе культивирования без подачи.
Раствор трипсина 0,25% (1X)	ГиКлон	SH30042.01	хранить при температуре 4 °C
2-Меркаптоэтанол	Gibco	21985023	хранить при температуре 4 °C и беречь от света
Чашка для клеточных культур 60 мм	Корнинг	430166
Центрифужная пробирка 15 мл	NUNC	No 339650 (Английский