Дифференцировка нейронных клеток-предшественников в нейроны

Аннотация

Источник: Мао, Х., и др. Дифференцировка нейронов из эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro. J. Vis. Exp. (2020).

В видео был продемонстрирован метод клеточной культуры для дифференцировки нейронных клеток-предшественников в нейроны. Путем инкубации клеток в богатой питательными веществами среде, дополненной факторами роста, клетки-предшественники созревали в нейроны с развитыми аксонами и дендритами. Стабилизирующий агент обеспечивал жизнеспособность клеток и защищал от окислительного повреждения на протяжении всего процесса дифференцировки.

Протокол

1. Дифференциация от NPC к нейронам (Фаза II)

1. Высадите около 5 x 10⁵ эмбриональных стволовых клеток мыши или производных mESC в пределах 2 мл базальной дифференцировочной среды I в лунку на 6-луночные планшеты, покрытые 0,1% желатином. Случайным образом разделите производные mESC на 3 группы, как протокол фазы II 1, протокол 2 и протокол 3 соответственно.
2. Поместите планшет в инкубатор с 5%_CO2 при температуре 37 °C, чтобы его можно было прикрепить, на 6 ч. Дважды промойте их 2 мл PBS.
3. Добавьте по 2 мл базальной дифференцировочной среды I, N2B27 среды I и N2B27 среды II (табл. 1) соответственно в каждую лунку из вышеуказанных групп.
4. Поместите пластины в инкубатор и дайте им дифференцироваться еще 10 дней. Меняйте соответствующий носитель каждые 2 дня.
5. Проверьте состояние дифференцировки и запишите морфологические изменения, как указано в шаге 3.
6. На 18-й день оцените генерацию нейронов (положительный β-тубулин III) и определите эффективность дифференцировки 3 протоколов, использованных на шаге 4.

Результаты

Таблица 1: Подробная информация о 3 протоколах, используемых в фазе II дифференцировки.

Фаза дифференцировки II (10d)
	Протоколы	медиа
Протокол 1	Естественная дифференцировка: При базальной дифференцировке только в среде I	Сре...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитело к β-тубулину III вырабатывается у кроликов	Сигма Олдрич	Т2200	хранить при -80 °С, не допускать многократной заморозки и размораживания
Добавка B-27 (50X), без сыворотки	Gibco	17504044	хранить при температуре -20 °C, и беречь от света
DME/F-12 1:1 (1 шт.)	ГиКлон	SH30023.01B	хранить при температуре 4 °C
Фетальная бычья сыворотка	ГиКлон	SH30084.03	хранить при -20 °С, не допускать многократной заморозки и размораживания
Флуоресцентная микроскопия	Олимп	СКХ53
желатин	Gibco	CM0635B	Хранить при комнатной температуре
Добавка GlutaMAX	Gibco	35050061	хранить при температуре 4 °C
Иммунологический окрашивающий первичный буфер для разведения антител	Бейотим	П0103	хранить при температуре 4 °C
Нокаут DMEM/F-12	Gibco	12660012	хранить при температуре 4 °C
MEM Раствор заменимых аминокислот	Gibco	11140076	хранить при температуре 4 °C
Добавка N-2 (100X)	Gibco	17502048	хранить при температуре -20 °C и беречь от света
Обычная козья сыворотка	джэксон	005-000-121 (Английский	хранить при -20 °C
Нейробазальная среда	Gibco	21103049	хранить при температуре 4 °C
Неадгезивная бактериальная тарелка	Корнинг	No 3262
Фосфатно-солевой буфер (1X)	ГиКлон	SH30256.01B	хранить при температуре 4 °C
Раствор пенициллина/стрептомицина	ГиКлон	SV30010	хранить при температуре 4 °C
PD0325901(Мирдаметиниб)	Селлек	С1036	хранить при -20 °C
Ретиноевая кислота	сигма	Р2625	хранить при температуре -80 °C и беречь от света
Штамм 129 Эмбриональные стволовые клетки мыши	Циаген	МУАЭС-01001	Поддерживается в системе культивирования без подачи.
2-Меркаптоэтанол	Gibco	21985023	хранить при температуре 4 °C и беречь от света
4% параформальдегида	Бейотим	П0098	хранить при -20 °C
6 - луночная пластина	Корнинг	No 3516
Чашка для клеточных культур 60 мм	Корнинг	430166
Центрифужная пробирка 15 мл	NUNC	No 339650 (Английский

) )