Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Диссоциация сенсорных ганглиев
- Нанесите пипеткой 500 мкл раствора для диссоциации ганглиев (GaDS) (Таблица 1), оставив ганглии в пробирке. Промойте ганглии один раз, добавив 1 мл фосфатного буферного раствора (PBS), подождите, пока ганглии осядут на дно пробирки, а затем отдайте PBS пипеткой.
- Добавьте 1 мл GaDS и 22 мкл фермента для пищеварения (коллагеназа I/II и смесь протеазы, 2,5 мг/мл в воде) в каждую пробирку.
- Добавьте 20 μл Fast Blue (5,26 мМ) в положительную контрольную трубку.
- Поставьте трубки на водяную баню или в нагревательный блок, установленный при температуре 37 °C.
- Каждые 15 минут коротко встряхивайте трубки и перелистывайте их, чтобы убедиться, что ганглии покрыты раствором.
заметка: Время переваривания ганглиев зависит от возраста фермента пищеварения. В течение одного месяца после растворения фермента пищеварения переварить в течение 30 минут; В течение 2 - 6 месяцев переварить 45 мин. Если фермент старше полугода, переваривайте ганглии в течение 60 минут.
- Пока ганглии варятся, приготовьте градиенты плотности с помощью раствора частиц (частиц коллоидного диоксида кремния, покрытых поливинилпирролидоном).
- Смешайте 12% раствор частиц в GaDS, 500 мкл на образец.
- Смешайте 28% раствор частиц с GaDS, 500 мкл на образец.
- Медленно и осторожно добавьте 400 мкл раствора 12% плотности поверх 400 мкл раствора 28% плотности в свежей пробирке объемом 1,5 мл для каждого образца. Не допускайте смешивания двух слоев. В трубке должны быть видны два отдельных слоя, один темнее другого.
- По истечении соответствующего времени разложения удалите GaDS с помощью фермента пищеварения и дважды промойте ганглии 1 мл PBS. Добавьте 200 μл свежего GaDS в каждую пробирку.
- Используйте пипетку объемом 200 мкл объемом 100 мкл и проводите пипеткой ганглии вверх и вниз несколько раз, чтобы разбить клетки. Повторяйте до тех пор, пока не останется неповрежденного кусочка ткани. Избегайте образования пузырей в растворе.
- Пропустите диссоциированные клетки через сетчатый фильтр 70 мкм.
- Добавьте еще 100 мкл GaDS в исходную диссоциационную пробирку, чтобы собрать оставшиеся паразитные клетки, и пропустите дополнительный раствор через сетчатое фильтр. С помощью нового наконечника для пипетки соберите остатки жидкости, содержащей клетки, которая прошла через сетчатый фильтр и прилипла к сетке. Конечный объем взвешенных в GaDS ячеек составляет 300 мкл.
- Аккуратно наложите 300 мкл клеток поверх ранее созданного градиента плотности. Избегайте образования пузырей и смешивания ячеек со слоями плотности.
- Центрифугируйте в течение 10 мин при 2 900 x g при RT.
- После завершения центрифугирования осторожно удалите и выбросьте верхний слой объемом 700 μл. Этот слой содержит большую часть клеточного мусора, который в противном случае будет мешать сортировке клеток.
- Добавьте 700 мкл свежего GaDS в оставшуюся ячейку, содержащую раствор, и несколько раз перемешайте пипеткой вверх и вниз.
- 18. Центрифугируйте в течение 15 мин при давлении 2 900 x g к пеллетным ячейкам.
- 19. После завершения центрифугирования осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость, оставив клеточную гранулу.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 - 300 мкл GaDS путем пипетирования вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1000 μл, установленной на 200 μл несколько раз. Положите образцы на лед.
Таблица 1. Смесь реагентов для раствора диссоциации ганглиев (GaDS).
| ингредиент | количество |
| Продвинутый DMEM/f12 | 9,5 мл |
| глутамин | 100 мкл |
| ГЕПЕС (10 мМ) | 100 мкл |
| Доплата N2 | 100 мкл |
| B27 (без витамина А) | 200 мкл |
| NGF (50 мкг/мл) | 10 мкл |
