Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол описывает метод подготовки и культивирования для долгосрочной инкубации и прерывистой визуализации срезов гиппокампа. Один срез гиппокампа прикрепляется к специально подготовленному фототравленному покровному стеклу с помощью плазменного сгустка, а затем покровные стекла запечатываются на плоской стороне просверленной роликовой трубки, которая хранится в роликовом инкубаторе.
1. Подготовка каркаса для роликовых труб
- Используйте шаблон, показанный на рисунке 1А, распечатанный в размере, указанном на масштабной линейке. Гвоздем проделайте небольшие отверстия (достаточно большие для маркера с мелкой точкой) в шаблоне по центру отверстий.
- Установите шаблон на дно 15-сантиметровой чашки для культуры тканей (номинальный диаметр 14 см) и отметьте расположение отверстий. Повторите это на втором блюде.
- С помощью сверл, предназначенных для работы с пластиком, просверлите шесть отверстий диаметром 1,5 см на каждой тарелке в шестиугольном массиве (4,8 см от центра к центру) с центрами отверстий на расстоянии 2,5 см от края тарелки. Просверлите три отверстия (диаметром 3 мм) на расстоянии 12 мм от края, которые расположены на равном расстоянии между двумя большими отверстиями, как показано на рисунке 1A.
- Поставив днища каждой посуды друг к другу, вставьте в одно из небольших отверстий машинный винт длиной 2,5 дюйма (диаметр 3/16 дюйма) с плоской шайбой, за которым следует вторая плоская шайба, кусок полиэтиленовой трубки (проставка, 4,7 см), еще одна плоская шайба, вторая чашка для культуры тканей, еще одна плоская шайба, стопорная шайба, и орех.
- Повторите шаг 1.4 на двух других крепежных винтах и затяните их очень слабо, пока все крепежные винты не окажутся на месте. Затем надежно затяните гайки.
- Вставьте втулки (толщиной 5/16 дюйма, диаметром отверстия 5/8 дюйма) в отверстия нижней чашки, чтобы получить окончательную решетку для роликовых труб (Рисунок 1B; показано с двумя установленными трубками). На каждую стойку наклейте наклейку с уникальным номером.
2. Подготовка роликовых трубок и покровных стекол
- Изготовление кондуктора для сверления отверстия в роликовых трубах
- Просверлите отверстие глубиной 1,5 см глубиной 8 см в центральной стороне деревянного бруска размером 2 x 4 x 5,5 дюйма под таким углом, чтобы плоская сторона роликовой трубы была почти параллельна блоку при вставке (Рисунок 2A).
- Увеличьте отверстие с помощью напильника из круглого дерева, чтобы расширить и сузить отверстие, чтобы можно было вставить трубку (роликовые трубки немного больше в диаметре рядом с концом крышки) (Рисунок 2B).
- Просверлите вертикальное отверстие диаметром 1,5 см, расположенное на расстоянии 5,5 см от бокового отверстия и расположенное по центру бокового отверстия (рисунок 2C).
- Когда боковое отверстие достаточно сужается, вставьте роликовую трубку, отмеченную в нужном месте, чтобы центрировать отверстие для среза, и расположите трубку так, чтобы отмеченное место было центрировано в вертикальном отверстии 1,5 см.
- Извлеките трубку и измерьте расстояние от пятна до конца трубки. Отметьте это расстояние от центра отверстия в кондукторе и вставьте гвоздь, чтобы обеспечить упор для правильного позиционирования трубки для сверления (стрелка на рисунке 2C).
- С помощью ножовки срежьте гвоздь вровень с поверхностью деревянного бруска, чтобы не получить травмы.
- Добавьте пружинные зажимы на дно кондуктора, если есть сверлильный станок с пазами, позволяющими его закрепить (Рисунок 2D черная стрелка). В противном случае используйте С-образные зажимы для надежного удержания приспособления на сверлильном станке.
- Используя описанный выше приспособление, чтобы удерживать и располагать плоскую пластиковую культуральную трубку диаметром 11 см плоской стороной вверх (рис. 2A), просверлите отверстие диаметром 6 мм с центром в 1,0 см от дна и по центру между сторонами трубки><.
заметка: Следует использовать сверло, предназначенное для пластика.
- С помощью поворотного инструмента для снятия заусенцев сгладьте края отверстия (Рисунок 2E) и сделайте 4 канавки на внутреннем крае отверстия (Рисунок 2E, вставка), чтобы облегчить дренаж отверстия во время вращения.
- С помощью дырокола 12 мм вырежьте диски диаметром 12 мм из нетоксичных двусторонних клейких листов силиконовой резины. С помощью стандартного дырокола для бумаги с одним отверстием (диаметр 6 мм) сделайте отверстие в центре каждого диска.
- Просверленные пробирки промыть 70% этанолом, высушить на воздухе в шкафу биологической безопасности и стерилизовать пробирки и перфорированные клеевые диски в течение 40 минут под ультрафиолетовой (УФ) лампой (30 Вт на среднем расстоянии 70 см) в шкафу биологической безопасности.
- Через 20 минут установите трубки и диски на место, чтобы все открытые поверхности были стерилизованы. В стерильных условиях снимите белую подложку с клейкого диска и прикрепите силиконовую резину к внешней стороне трубки, совместив отверстия (Рисунок 2F).
осторожность: Чтобы избежать воздействия ультрафиолета, наденьте защитные очки и закройте шкаф перед включением УФ-лампы.
- Чистые фототравленные 12 мм диаметром 12 мм (100 пронумерованных по центру квадратов 1 мм) немецкие стеклянные покровные стекла. Осторожно держите покровные стекла щипцами и окуните их в абсолютный этанол, затем в воду, затем снова в абсолютный этанол, и, наконец, окуните покровные стекла в пламя, чтобы сжечь этанол. Дайте покровным стеклам остыть.
- Удерживая покровные листы щипцами, погрузите в 2% 3-аминопропилтриэтоксисилан в ацетон на 10 с. Промойте покровные листы ультрачистой водой и дайте высохнуть на воздухе.
- Установите покровные стекла на стерильную фильтровальную бумагу внутри шкафа биологической безопасности и включите ультрафиолетовый свет. Выставить каждую сторону покровных стекол на 20 мин.<бр/>
осторожность: Чтобы избежать воздействия ультрафиолета, наденьте защитные очки и закройте шкаф перед включением УФ-лампы.
3. Подготовка среза гиппокампа
- Перед началом вскрытия подготовьте половинки обоюдоострых бритвенных лезвий для измельчителя тканей. Аккуратно сложите лезвия вдоль пальцами и защелкните пополам.
- Промойте половинки лезвия ацетоном с помощью ватного тампона для их очистки, после чего промойте в абсолютном этаноле и высушите на воздухе. Перед установкой полулезвия на измельчитель тканей простерилизуйте его, промыв 70% этанолом.
- Следуйте протоколам, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию; после анестезии изофлураном усыпьте 4-7-дневного детеныша мыши или крысы путем обезглавливания и удалите голову ножницами или гильотиной><.
заметка: Протокол культивирования среза мозга не зависит от штамма или генотипа мыши или крысы. Было использовано множество трансгенных линий мышей с различным генетическим фоном.
- Промойте голову 70% этанолом и поместите ее в чашку Петри диаметром 60 мм. До окончательного монтажа среза мозга на роликовую трубку все следующие этапы выполняются в колпаке с ламинарным потоком для поддержания стерильности.
- С помощью хирургического лезвия #21 сделайте сагиттальный разрез кожи и черепа. С помощью щипцов Дюмона #5 снимите кожу и череп, чтобы обнажить мозг.
- Закрытыми щипцами аккуратно вытяните весь мозг, освободив его, зажав щипцами через ствол мозга за мозжечком. Поместите мозг в стерильную чашку диаметром 60 мм, содержащую 4 °C сбалансированного раствора соли Гея/0,5% глюкозы (GBSS/глюкоза).
- Используя диссекционный микроскоп для визуализации мозга (рис. 3А), поместите мозг тыльной стороной вверх и отрежьте переднюю треть мозга и мозжечок хирургическим лезвием (рис. 3В).
- С помощью щипцов держите обрезанную заднюю сторону мозга вверх и вентральную сторону к боковой стороне чашки Петри для устойчивости. Аккуратно удалите мозговые оболочки вокруг сагиттальной средней линии и удалите ткань среднего мозга с помощью щипцов Dumont #5 с тонким наконечником (рисунок 3C, пунктирный круг).
- Сделайте два надреза вдоль боковой части мозга, чтобы раздвинуть его (рисунок 3В, пунктирные линии). После того, как мозг расположен тыльной стороной вниз и широко раскрыт, должна быть видна щель гиппокампа (рисунок 3D, стрелка).
- Перенесите раскрытый открытый мозг на кусок полихлортрифторэтиленовой пластиковой пленки и расположите его для нарезки на столике измельчителя тканей. Смочите лезвие GBSS/глюкозой и разрежьте гиппокамп на ломтики толщиной ~300 мкм.
- С помощью переводной пипетки смойте срезанный мозг с пластиковой пленки в свежую 60-миллиметровую чашку, содержащую ГБСС/глюкозу (Рисунок 3E). Аккуратно отщипните и отденьте щипцами с тонкими наконечниками оставшиеся мозговые оболочки и другую ткань, не относящуюся к гиппокампу (рисунок 3F) от срезов (рисунок 3G, H).
4. Гальванизация ломтиков
- После того, как ломтики будут получены, поместите 2 мкл куриной плазмы в центр фототравляемой стороны подготовленного покровного стекла. Слегка распределите плазму, чтобы получить пятно диаметром 3-4 мм.
заметка: Фототравленная сторона — это верхняя сторона покровного стекла при просмотре через микроскоп для вскрытия таким образом, чтобы числа были правильно ориентированы.
- Перенесите 1 срез мозга стерильным узкоконцевым шпателем (рисунок 4A) в место плазмы (рисунок 4B). Используйте закрытые щипцы, чтобы удерживать срез на кончике шпателя, одновременно поднимая срез из GBSS/глюкозы.
- Прикоснитесь шпателем к месту плазмы на покровном листе, и закрытыми щипцами надавите на срез на покровный лист.
- Смешайте 2,5 мкл плазмы с 2,5 мкл тромбина в отдельной пробирке. Быстро нанесите 2,5 мкл этой смеси на ломтик и осторожно передайте его вверх и вниз, чтобы перемешать (рис. 4B).
заметка: Плазма сворачивается в течение 10-15 с, поэтому делать это нужно быстро. Если адгезия среза является проблемой, смешайте 5 μL плазмы с 5 μL тромбина и используйте 4-5 μL на срез, удалив часть после смешивания так, чтобы ломтик лежал ровно на покровном листе.
- Снимите прозрачное пластиковое покрытие с открытой стороны силиконового каучукового клея, ранее прикрепленного к роликовой трубке, и поместите покровное стекло со срезом мозга на клей, выровняв срез внутри отверстия (Рисунок 4C).
- Чтобы обеспечить адгезию, мягко, равномерно надавите на покровное стекло большим пальцем, равномерно прижав покровное стекло и удерживая его около 1 минуты, перекладывая в шкаф биологической безопасности.
- В боксе биологической безопасности добавьте 0,8 мл полной питательной среды для нейробазала А (Таблица материалов) в каждую пробирку (Рисунок 4D).
- Пропустите воздушную смесь 5% CO2/95% через стерильную ватную пипетку Пастера с хлопчатобумажной пробкой, надежно удерживаемую зажимом. Промойте трубку ролика газовой смесью и быстро закройте трубку по мере ее извлечения из пипетки.
- Наклейте на пробирки номер среза и номер штатива. Вставьте трубки в роликовый штатив, убедившись, что они геометрически сбалансированы. Если есть нечетное количество трубок, добавьте трубки для баланса.
- Поместите стеллажи в роликовый инкубатор с температурой 35 °C с роликами, поворачивающими роликовый стеллаж примерно на 10-13 оборотов в час (RPH) (рис. 4E). Чтобы удержать среду на дне пробирок, наклоните инкубатор назад примерно на 5°, подняв его переднюю часть на доске.
