1. Стандартизация нейронных культур с помощью микрофлюидных устройств: сборка устройства
- Выберите подходящее микрофлюидное устройство для проведения желаемого эксперимента. Чтобы соединить нейроны в одной популяции, используйте нейроустройства (рис. 1), а чтобы соединить нейроны в разных популяциях, используйте устройства для совместной культуры (рис. 2).
- Очистите и подготовьте нужное количество стерильных покровных стекол или посуды со стеклянным дном. Для достижения наилучших результатов на пластиковых поверхностях используйте посуду 35 мм, на стеклянной — покровные стекла 25 мм или посуду со стеклянным дном 35 мм. Выберите толщину стекла в зависимости от системы визуализации, например, 0,15 мм.
- Смажьте посуду или покровные салфетки 0,5-1 мл 100 мкг/мл PDL на 2 ч или на ночь при комнатной температуре.
заметка: Протокол можно приостановить здесь и возобновить на следующий день, если это необходимо. Кроме того, чашки могут быть покрыты PDL, разбавленным боратным буфером, поли-L-лизином (PLL), ламинином или любой другой молекулой клеточной адгезии.
- Дважды вымойте посуду водой (не используйте фосфатно-солевой буфер (PBS), так как кристаллы соли могут заблокировать каналы), удалите всю жидкость и дайте ей высохнуть в стерильной среде, например, в шкафу биобезопасности, в течение 5-10 минут или пока поверхность полностью не высохнет><.
заметка: Будьте осторожны, чтобы убедиться, что покровные стекла абсолютно сухие, так как любая оставшаяся жидкость будет мешать прилипанию микрофлюидных систем.
- Поместите микрофлюидные устройства узорами вверх под ультрафиолетовое излучение в стерильную среду (бокс биобезопасности) на 10 мин. Обязательно соблюдайте стерильные процедуры при работе в боксе биобезопасности10.
- С помощью пинцета поместите микрофлюидное устройство узором вниз в контакт с чистым покровным стеклом/чашкой. С помощью пинцета мягко надавите на устройство, чтобы оно прилипло к стеклу.
заметка: Прозрачность приклеенного участка будет видна при взгляде против света. Убедитесь, что все углы соприкасаются со стеклом. Проделайте это со всеми микрофлюидными устройствами. Смотрите рисунок 1а.
- Чтобы заполнить однопопуляционное устройство средой, направьте пипетку в сторону каналов и добавьте 50 мкл полной клеточной среды с добавлением бессывороточного В-27 (объемное отношение 1:50) и 500 мкг/мл пенициллина/стрептомицина/глутамина (совместно называемых NBM) в правую верхнюю лунку, а затем добавьте еще 50 мкл в лунку, лежащую по диагонали от нее. Делайте это для всех устройств, следя за тем, чтобы среда перетекала между скважинами. Далее добавьте 50 μL среды в оставшиеся две лунки. Смотрите рисунок 3а.
- Чтобы заполнить устройство с несколькими популяциями средой, направьте пипетку в сторону каналов и добавьте 30 мкл полного NBM в нужные лунки, см. Рисунок 2a. Делайте это для всех устройств, следя за тем, чтобы среда перетекала между скважинами. Далее добавьте 50 мкл среды в оставшиеся четыре лунки.
- Поместите устройства в большую тарелку с открытой чашкой с автоклавной водой (влажная камера) и поместите в инкубатор (37 °C, 5%CO2 и 95% влажности) на 1-2 часа во время подготовки клеточной культуры. Смотрите рисунок 3b.
2. Покрытие нейронов в микрофлюидных системах
- Следуя протоколу, получите диссоциированные нейроны гиппокампа или коры головного мозга из эмбрионов крысы Sprague Dawley (любого пола).
- Ресуспензируйте эмбриональные нейроны в НБМ в концентрации 1-2 млн нейронов/мл. Проверьте концентрацию клеток в микроскопе с помощью гемоцитометра и по ссылке8. Отрегулируйте концентрацию клеток в соответствии с желаемой плотностью клеток. Чтобы увеличить шансы на получение одиночных аксонов гиппокампа на канал, наложите 10 000 нейронов на устройство. Чтобы иметь несколько аксонов в одном канале, наложите 60 000 нейронов на устройство><.
Примечание: Эти цифры варьируются в зависимости от используемого типа нейронов.
- Удалите среду из микрофлюидных устройств, не опорожняя лунки. Оставьте примерно 5 μл в каждом.
- Для пластинчатых клеток в устройстве с одной популяцией добавьте 50 мкл NBM в нижнюю правую лунку. В этот момент среда течет сама по себе, чтобы заполнить другой нижний колодец. Добавьте 20 мкл раствора концентрата в верхнюю правую лунку микрофлюидного устройства, как показано на рисунке 1b.
- В пластинчатые ячейки в устройстве с множественной популяцией добавьте по 20 мкл раствора концентратной ячейки в каждую из правильных лунок, показанных на рисунке 2a.
- Проверьте в микроскоп, находятся ли клетки внутри камер, и поместите устройства в инкубатор на 15-30 минут, чтобы способствовать прикреплению клеток к субстрату.
- Проверьте в микроскоп, достаточно ли клеток в камерах. Если требуется больше, повторите шаги 2.4 и 2.5.
- Добавьте 50 мкл NBM в 2 верхние лунки устройства с одной популяцией и 20 мкл NBM в ту же лунку, в которую клетки были введены в устройство с множественной популяцией. Фильтрующий материал немного выступает, образуя положительный мениск, придавая лункам верхнюю сторону кекса. Опять же, см. Рисунок 3а.
- Поддерживайте в клетках температуру 37 °C, 5%CO2 и влажность 95%.
3. Поддержание нейронных культур
- Удалите NBM (примерно 30 μL с помощью пипетки) из клеток и внесите новый предварительно нагретый NBM на следующий день после их введения в устройства (то есть через 1 день после шага 2).
- Проверяйте каждые 2 дня, достаточно ли канала в каждом канале. Если верх кекса низкий, просто добавьте больше среднего в верхние лунки.
- Культивируйте клетки не менее чем за 7 дней до удаления микрофлюидных устройств. Клетки могут выживать в этих устройствах в течение нескольких недель. Извлеките приборы за 1-2 дня до проведения экспериментов на образцах.
4. Удаление микрофлюидных устройств
- За 1 - 2 дня до снятия микрофлюидных устройств добавьте 2 мл НБМ, предварительно подогретых до 37 °С, в каждую чашку с образцом, заливая камеры, и поддерживайте устройства в инкубаторе.
- Используйте стерильный пинцет и один наконечник для удаления микрофлюидных устройств с покровных стекол, оставляя узорчатую конфигурацию нейронов. Используйте наконечник, чтобы удерживать покровное стекло на месте, и пинцетом, чтобы обхватить край устройства в нижнем левом углу лунки. Аккуратно нанесите торсион, поднимая прибор пинцетом вверх так, чтобы с него оторвался покровный стекло. Смотрите рисунок 3c-3d.
- Каждые 2-3 дня заменяйте половину НБМ до тех пор, пока образец не будет использован для экспериментов.
- Перед проведением экспериментов по переподключению образца убедитесь, что нейриты в каналах устройства с одной популяцией и нейронные популяции в устройстве с множественной популяцией изолированы, исследуя промежутки между ними в микроскопе, чтобы убедиться в отсутствии нитей, связывающих нейронные популяции.
5. Приготовление бусин с покрытием PDL
- Добавьте 2 капли по 50 μл гранул полистирола 4, 10 или 20 μм, разведенных в воде (1:500), до 1 мл PDL (100 μг/мл). Оставьте минимум на 2 часа при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь и возобновлен на следующий день.
- Центрифугируйте раствор при 8 820 х г в течение 1 мин. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив шарики, скопившиеся на дне контейнера.
- Дважды промойте бусины 1 мл стерильного 10 мМ раствора HEPES pH 8,4.
- Суспендируйте гранулы с покрытием PDL в 200 мл 10 мл раствора HEPES pH 8,4.
6. Подготовка микропипеток
- Подготовьте пипетки из стеклянных капиллярных трубок (внутренний диаметр 1 мм, внешний диаметр 1,5 мм) с помощью горизонтального электродного съемника. Отрегулируйте настройки так, чтобы внешний кончик вытянутой микропипетки составлял ~ 2-5 мкм. Прежде чем вытягивать, убедитесь, что стеклянные трубки чистые.
- Закрепите пипетки на стеклянных предметных стеклах для хранения и убедитесь, что наконечник не соприкасается с поверхностью предметного стекла, так как наконечник хрупкий. Хранить при комнатной температуре в закрытой таре для защиты от пыли. Используйте пипетки в тот же день, когда их вытягивают.
7. Адгезия PDL-гранул к нейронам
- Добавьте 40-60 мкл гранул с покрытием PDL, приготовленных на этапе 5, в культуру клеток, приготовленную на этапе 4. Расположите кончик пипетки над нейронами, которые слабо видны на покровном листе, и добавьте шарики (см. рисунок 4).
- Верните образец в инкубатор на 1 ч, чтобы способствовать образованию синаптических контактов.
- После инкубации удалите все неприлипшие гранулы, аккуратно промыв культуру предварительно подогретым НБМ.
8. Приготовление физиологического раствора (для экспериментов при комнатной температуре)
- Приготовьте физиологический раствор. Это необходимо для регулирования клеточной среды за пределами инкубатора.
- Проверьте осмолярность и уровень pH.
- Непрерывно вливайте раствор сO2, чтобы свести к минимуму колебания pH при проведении экспериментов.
- Нагрейте до комнатной температуры.
- Настройте систему перфузии, вставив один конец пластиковой трубки (возможные размеры) в физиологический раствор, настоянный наО2, и закрепив другой конец на игле, вставленной в держатель образца. Поместите трубку и раствор выше образца (см. рисунок 5).
- Отсоедините трубку от иглы и подсоедините ее к шприцу. С помощью шприца надавите и наберите жидкость, заполнив трубку. Запечатайте роликовым хомутом и снова подсоедините иглу.
9. Микроманипуляции с бусинами
- Установите образец в экспериментальную установку таким образом, чтобы доступ к клеткам можно было получить сверху с помощью двух микропипеток, установленных в микроманипуляторах, и оптически получить доступ внизу, например, с помощью объектива с 40-кратной фазой (числовая апертура 0,6) инвертированного оптического микроскопа. В этой конфигурации установите ПЗС-камеру для захвата изображений на боковой порт микроскопа. Подсоедините каждую пипетку к шприцам объемом 1 мл с помощью пластиковой трубки. На этом этапе замените НБМ физиологическим раствором (1-2 мл) (см. рисунок 5).
- Во время экспериментов непрерывно перфузировали клетки физиологическим раствором, приготовленным на стадии 8 со скоростью 0,5-1 мл/мин.
- Выберите бусину PDL, НЕ прикрепленную к нейрону в поле зрения. Совместите бусину с наконечником микропипетки, сосредоточившись на бусине, а затем вверх к микропипетке. Опустите кончик как можно ближе к бусине, наблюдая за ней через микроскоп.
- Приложите отрицательное давление с помощью шприца объемом 1 мл, подключенного к пипетке, чтобы собрать шарик. Поддерживайте отрицательное давление на протяжении всего эксперимента.
10. Вытягивание нейритов
- Выберите шарик PDL, прикрепленный к нейрону в поле зрения, и прикрепите его ко второй микропипетке с помощью отсасывания, как описано в шагах 9.3-9.4.
- Медленно потяните комплекс PDL-бусина-нейрон (~0,5 мкм/мин), перемещая либо микроманипулятор, либо ступень образца на 1 мкм и делая паузу на 5 минут, чтобы дать возможность инициации нейритов.
- Повторите шаг 10.2 дважды.
Примечание: Первые 3 мкм должны быть вытянуты очень медленно, чтобы гарантировать успех эксперимента, который происходит более чем в 95% случаев.
- Медленно (~0,5 мкм/мин) перемещая микроманипулятор или предметный столик на 2 мкм, потяните комплекс PDL-бусина-нейрон и сделайте паузу на 5 минут, чтобы обеспечить удлинение нейритов.
- После успешного начала и удлинения нейрита в течение первых 5 мкм вытягивайте нейрит со скоростью 20 мкм/мин на расстояния миллиметрового масштаба.
Примечание: Вытягивание может выполняться непрерывно или поэтапно и с разной скоростью. Смотрите рисунок 6b-6c.
11. Соединение нейронов
- Выберите регион, богатый нейритами, и опустите комплекс PDL-бусина-нейрит так, чтобы он физически контактировал с ним. Используйте другие бусины, чтобы измерить высоту кончика над поверхностью покровного стекла. Смотрите рисунок 6d.
- Оставьте комплекс PDL-бусина-нейрит в контакте с целевым нейритом во время манипуляций со второй микропипеткой. Опустите вторую пипетку со вторым PDL-шариком поверх вновь образованного нейрита примерно в 20 мкм от первого шарика. Используйте вторую PDL-бусину, чтобы протолкнуть новую нейритовую нить к целевой клетке.
- Удерживайте обе бусины на месте не менее 1 ч. Проверьте с помощью микроскопа отсутствие очагового отека, утолщения нейритов, контактирующих с бусиной16.
- В течение этого времени с помощью перфузии медленно изменяйте среду образца с физиологического раствора на предварительно нагретую, уравновешенную CO2-НБМ.
- Освободите шарик от второй пипетки, отпустив всасывание. Если новый нейрит остается прикрепленным, отпустите и первую бусину. Смотрите рисунок 6е.
- Аккуратно удалите солевой раствор и замените его на NBM (~2 мл).
- Осторожно поместите образец обратно в инкубатор, чтобы укрепить нейронную связь для будущих экспериментов. Данное соединение стабильно в течение >24
