Генерация нейронов путем перепрограммирования клеток дермальных фибробластов человека

Аннотация

Источник: Shrigley, S., et al. Простое генерирование высокопродуктивной культуры индуцированных нейронов из фибробластов кожи взрослого человека. J. Vis. Exp. (2018)

Видео демонстрирует генерацию нейронов из дермальных фибробластов взрослого человека (aHDFs). aHDF перепрограммируются с помощью лентивирусного вектора, несущего гены нейрональных транскрипционных факторов и коротких шпилечных РНК (шРНК). ШРНК ингибируют экспрессию нейронального репрессора транскрипции, а факторы нейронной транскрипции активируют гены для дифференцировки aHDF в нейроны. Эти перепрограммированные aHDF культивируются в среде ранней и поздней конверсии нейронов для генерации зрелых нейронов.

Протокол

1. Подготовка фибробластов кожи к перепрограммированию

1. Используя автоматизированную систему размораживания клеток или водяную баню при температуре 37 °C, разморозьте дермальные фибробласты взрослого человека (aHDFs) и наплавьте их в 200 000 на колбу T75 (подсчитывайте с помощью автоматического счетчика клеток) в 10 мл среды фибробластов (см. Таблицу 1) при 37 °C в 5%_CO2.
2. На следующий день проведите полную замену среды фибробластами.
3. Меняйте среду фибробластов каждые 3–4 дня до тех пор, пока клетки не достигнут 95% конфлюенции.
   заметка: Одна конфлюентная колба будет содержать примерно 1 000 000 клеток.

2. Покрытие для перепрограммирования (День −1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать желатиновое покрытие для краткосрочных экспериментов (до 30 дней); в качестве альтернативы, для долгосрочных экспериментов рекомендуется начинать с поли-L-орнитина, фибронектина и ламинина (PFL) покрытия.

1. За 60 минут до нанесения покрытия на aHDF для перепрограммирования покройте 24-луночный планшет 0,1% желатина (250 мкл/лунка) и инкубируйте при 37 °C.
2. Аспирируйте среду фибробластов на aHDFs. Умойтесь один раз фосфатным буферным раствором Дульбекко (DPBS). Диссоциировать клетки 0,05% трипсином (1,5 мл на колбу Т75) при 37 °С в течение 3–5 мин.
3. Добавьте среду фибробластов для нейтрализации трипсина (3 мл на промывку на колбу Т75) и соберите отделенные клетки в пробирку объемом 15 мл, дважды промыв клетки в колбе.
4. Вращайте клетки при 400 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды фибробластов.
5. Подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток (чтобы обеспечить хорошее качество конверсии, убедитесь, что жизнеспособность клеток превышает 90% с помощью окрашивания трипановым синим).
6. Для полного 24-луночного планшета приготовьте суспензию из 1 320 000 клеток в 13,2 мл фибробластной среды с получением суспензии 100 000 клеток/мл среды (или 55 000 клеток/лунку в 550 мкл фибробластной среды, умноженной на необходимое количество лунок).
7. Отсадите желатин из тарелки и дважды промойте DPBS. Добавьте по 500 мкл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубируйте в течение ночи при 37 °C при 5%_CO2.

3. Вирусная трансдукция (день 0)

ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с лентивирусными частицами требует оборудования категории 2 и использования агента для нейтрализации вируса. Также настоятельно рекомендуется надевать двойные пары перчаток.

1. Прогрейте 13,2 мл фибробластной среды до 37 °С.
2. Разморозьте лентивирусный вектор, содержащий факторы транскрипции семейства achaete-scute bHLH транскрипционный фактор 1 (Ascl1) и Brn2 с двумя короткими шпильками (shRNA), нацеленными на RE1-сайленсинг транскрипционный фактор (REST) при комнатной температуре.
3. Добавьте необходимый объем лентивируса для инфицирования aHDF при кратности инфекции (MOI) 20 в среду без каких-либо усилителей трансдукции.
   
4. Замените среду в 24-луночном планшете средой фибробластов, содержащей лентивирусный вектор (500 мкл/лунку) и инкубируйте в течение ночи при 37 °C при 5%_CO2.
5. На следующий день замените среду в лунках свежей средой фибробластов без лентивирусного вектора.
   заметка: Среда считается заразной в течение 7 дней, поэтому в течение первой недели после вирусной трансдукции следует использовать адекватные меры защиты и обработки.

4. Обслуживание преобразующих ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Как только начинается преобразование, клетки подвержены подъему; будьте осторожны, наклоняйте планшет вверх и используйте пипетку объемом 1,000 мкл при удалении среды, чтобы избежать отслоения клеток.

1. На 3-й день удалите среду фибробластов и добавьте 500 мкл среды для ранней конверсии нейронов (см. Таблицу 1).
2. Два-три раза в неделю вынимайте из лунки 225 мкл старой среды и добавляйте 250 мкл свежей среды для ранней конверсии нейронов.
3. На 18-й день удалите всю среду из каждой лунки и замените 500 мкл среды для поздней конверсии нейронов (см. Таблицу 1).
4. Продолжайте менять половину среды, как описано выше, с помощью среды позднего преобразования нейронов каждые 2–3 дня до 25-го дня или конечной точки эксперимента (рисунок 1A).

Таблица 1. Состав различных используемых сред. Полное описание состава для сред, необходимых в этом протоколе, включая среду фибробластов, среду раннего преобразования нейронов, среду позднего преобразования нейронов.

	Концентрация запасов	Рабочая концентрация
Среда фибробластов
Базальная среда	Н/Д	Н/Д
Пенициллин/стрептомицин	10 000 Ед/мл	100 мг/мл
ФБС	Н/Д	10%
Среда раннего преобразования нейронов (ENM)
Среда нейронной дифференцировки	Н/Д	Н/Д
Пенициллин/стрептомицин	10 000 Ед/мл	100 мг/мл
CHIR99021	10 мМ	2 мкМ
СБ-431542	20 мМ	10 μМ
башка	100 мкг/мл	0,5 мкг/мл
ЛДН-1931189	10 мМ	0,5 мкМ
ВПА	1 М	1 мМ
ЛМ-22А4	20 мМ	2 мкМ
ГДНФ	20 мкг/мл	2 нг/мл
НТ3	10 мкг/мл	10 нг/мкл
db-cAMP	50 мМ	0,5 мМ
Среда позднего преобразования нейронов (LNM)
Среда нейронной дифференцировки	Н/Д	Н/Д
Пенициллин/стрептомицин	10 000 Ед/мл	100 мг/мл
ЛМ-22А4	20 мМ	2 мкМ
ГДНФ	20 мкг/мл	2 нг/мл
НТ3	10 мкг/мл	10 нг/мкл
db-cAMP	50 мМ	0,5 мМ

Результаты

Рисунок 1: Эволюция преобразования iN с течением времени.(А) Хронология эксперимента и карта конструкции, упакованной в лентивирус, используемый для перепрограммирования дермальных фибробластов взрослого человека. Каждая черная стрелка представляет собой среднее изменение. (B) Репрезентативные фазово-контрастные изображения, показывающие изменения морфологии клеток в...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клеточные линии
Дермальные фибробласты взрослого человека			[C2 отрывок #7] Донором была 67-летняя женщина. Клетки получены из клиник исследований болезни Паркинсона и болезни Хантингтона в Центре восстановления мозга имени Джона ван Геста (Кембридж, Великобритания).
Реагенты для культивирования, трансдукции и конверсии фибробластов
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]	Gibco	14190094
Трипсин-ЭДТА [0.5%]	Gibco	15400-054	Разбавить до 0,05% в DPBS.
Виркон (средство, используемое для нейтрализации вирусов)	Виродерм	7511	Разведите до 1% раствора теплой водой.
Вода Milli-Q	Многородность
Базальная среда - модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax	Gibco	61965059
Пенициллин/стрептомицин [10,000 ЕД/мл]	Gibco	15140-122
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco	10270-106
Диметилсульфоксид (ДМСО) CryoMACS® 10	Милтеньи	Тел.: 170-076-303
Среда нейронной дифференцировки - NDiff 227	Такара-Клонтех	У40002
ЛМ-22А4	Токрис	4607	Разведите 10 мг в 1450 μл ДМСО.<бр/> Концентрация в запасе: 20 мМ.
Нейротрофический фактор глиальных клеток (GDNF) [рекомбинантный человек]	Системы НИОКР	212-ГД-010	Развести 10 мкл в 500 мкл 0,1% БСА в DPBS. Исходная концентрация: 20 мкг/мл.
NT3 [рекомбинантный человек]	Системы НИОКР	267-Н3-025	Разведите 25 мкг в 2,5 мл 0,1% БСА в DPBS. Исходная концентрация: 10 мкг/мл.
db-cAMP	Сигма Олдрич	Д0627	Развести 1 г в 40,7 мл воды Milli-Q.<бр/> Отфильтруйте и сделайте аликвоты по 500 мкл или пробирки по 10 мл. Концентрация материала: 50 мМ.
CHIR99021	аксон	1386	Развести 2 μг в 429,8 μL DMSO. Исходная концентрация: 10 мМ.
ЛДН-193189	аксон	1509	Разведите 2 мг в 360 мкл ДМСО.<бр/> Исходная концентрация: 10 мМ.
Натриевая соль вальпроевой кислоты (ДПА)	Мерк Миллипор	676380 (Английский	Разведите 5 г в воде Milli-Q до достижения исходной концентрации 1 М. ВНИМАНИЕ: Избегайте проглатывания, контакта с кожей и вдыхания образования пыли.
Реагенты для покрытий
желатин	Сигма Олдрич	Г2500	Разведите до 0,1% в воде Milli-Q.
Поли-L-орнитин	Сигма Олдрич	П3655	Растворите в воде Milli-Q. Используйте при концентрации 15 мкг/мл.
Фибронектин	ThermoFisher Scientific	33010-018 (Английский)	2 мл воды Milli-Q + 70 мкл 0,25 М NaOH. Использовать при концентрации 5 мкг/мл.
Ламинин	ThermoFisher Scientific	No 23017-015	Хранить при температуре -80°C. Разморозьте на льду, храните в прохладе до 30 мкл. Используйте при концентрации 5 мкг/мл.
оборудование
Колба T75 [Nunclon Delta Surface]	ThermoFisher Scientific	156499
24-луночный планшет [Nunc]	ThermoFisher Scientific	142485
Полипропиленовая трубка 1,5 мл	Сигма Олдрич	Z336769
15 мл соколиной пробирки	Сарштедт	6,25,54,502
Соколиная трубка 50 мл	Сарштедт	6,25,47,254
Контроллер Pippette			Для пипетирования объемы 1-25 мл.
Стерильные серологические пипетки: 5, 10 и 25 мл	Сарштедт	86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Дозаторы с регулируемым объемом: 5, 20, 200 и 1 000 μл
Стерильные наконечники для пипеток			Для пипетирования объемом 0,5 - 1 000 μл.
ThawSTAR Автоматизированная система размораживания ячеек	БиоЦисион,	БКС-601
Автоматизированный счетчик ячеек Countess II	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000
Камеры для подсчета клеток [50 слайдов] и трипановый синий [0,4%]	ThermoFisher Scientific	С10228	Для использования с автоматическим счетчиком ячеек Countess II.
Ламинарный колпак
Инкубатор с влажностью 5% CO2 37 °C
центрифуга			Подходит для пробирок объемом 1,5, 15 и 50 мл.
Орбитальный шейкер
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Лейка	DMI6000 В