1. Подготовка фибробластов кожи к перепрограммированию
- Используя автоматизированную систему размораживания клеток или водяную баню при температуре 37 °C, разморозьте дермальные фибробласты взрослого человека (aHDFs) и наплавьте их в 200 000 на колбу T75 (подсчитывайте с помощью автоматического счетчика клеток) в 10 мл среды фибробластов (см. Таблицу 1) при 37 °C в 5%CO2.
- На следующий день проведите полную замену среды фибробластами.
- Меняйте среду фибробластов каждые 3–4 дня до тех пор, пока клетки не достигнут 95% конфлюенции.
заметка: Одна конфлюентная колба будет содержать примерно 1 000 000 клеток.
2. Покрытие для перепрограммирования (День −1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать желатиновое покрытие для краткосрочных экспериментов (до 30 дней); в качестве альтернативы, для долгосрочных экспериментов рекомендуется начинать с поли-L-орнитина, фибронектина и ламинина (PFL) покрытия.
- За 60 минут до нанесения покрытия на aHDF для перепрограммирования покройте 24-луночный планшет 0,1% желатина (250 мкл/лунка) и инкубируйте при 37 °C.
- Аспирируйте среду фибробластов на aHDFs. Умойтесь один раз фосфатным буферным раствором Дульбекко (DPBS). Диссоциировать клетки 0,05% трипсином (1,5 мл на колбу Т75) при 37 °С в течение 3–5 мин.
- Добавьте среду фибробластов для нейтрализации трипсина (3 мл на промывку на колбу Т75) и соберите отделенные клетки в пробирку объемом 15 мл, дважды промыв клетки в колбе.
- Вращайте клетки при 400 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды фибробластов.
- Подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток (чтобы обеспечить хорошее качество конверсии, убедитесь, что жизнеспособность клеток превышает 90% с помощью окрашивания трипановым синим).
- Для полного 24-луночного планшета приготовьте суспензию из 1 320 000 клеток в 13,2 мл фибробластной среды с получением суспензии 100 000 клеток/мл среды (или 55 000 клеток/лунку в 550 мкл фибробластной среды, умноженной на необходимое количество лунок).
- Отсадите желатин из тарелки и дважды промойте DPBS. Добавьте по 500 мкл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубируйте в течение ночи при 37 °C при 5%CO2.
3. Вирусная трансдукция (день 0)
ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с лентивирусными частицами требует оборудования категории 2 и использования агента для нейтрализации вируса. Также настоятельно рекомендуется надевать двойные пары перчаток.
- Прогрейте 13,2 мл фибробластной среды до 37 °С.
- Разморозьте лентивирусный вектор, содержащий факторы транскрипции семейства achaete-scute bHLH транскрипционный фактор 1 (Ascl1) и Brn2 с двумя короткими шпильками (shRNA), нацеленными на RE1-сайленсинг транскрипционный фактор (REST) при комнатной температуре.
- Добавьте необходимый объем лентивируса для инфицирования aHDF при кратности инфекции (MOI) 20 в среду без каких-либо усилителей трансдукции.
- Замените среду в 24-луночном планшете средой фибробластов, содержащей лентивирусный вектор (500 мкл/лунку) и инкубируйте в течение ночи при 37 °C при 5%CO2.
- На следующий день замените среду в лунках свежей средой фибробластов без лентивирусного вектора.
заметка: Среда считается заразной в течение 7 дней, поэтому в течение первой недели после вирусной трансдукции следует использовать адекватные меры защиты и обработки.
4. Обслуживание преобразующих ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только начинается преобразование, клетки подвержены подъему; будьте осторожны, наклоняйте планшет вверх и используйте пипетку объемом 1,000 мкл при удалении среды, чтобы избежать отслоения клеток.
- На 3-й день удалите среду фибробластов и добавьте 500 мкл среды для ранней конверсии нейронов (см. Таблицу 1).
- Два-три раза в неделю вынимайте из лунки 225 мкл старой среды и добавляйте 250 мкл свежей среды для ранней конверсии нейронов.
- На 18-й день удалите всю среду из каждой лунки и замените 500 мкл среды для поздней конверсии нейронов (см. Таблицу 1).
- Продолжайте менять половину среды, как описано выше, с помощью среды позднего преобразования нейронов каждые 2–3 дня до 25-го дня или конечной точки эксперимента (рисунок 1A).
Таблица 1. Состав различных используемых сред. Полное описание состава для сред, необходимых в этом протоколе, включая среду фибробластов, среду раннего преобразования нейронов, среду позднего преобразования нейронов.
| Концентрация запасов | Рабочая концентрация |
| Среда фибробластов |
| Базальная среда | Н/Д | Н/Д |
| Пенициллин/стрептомицин | 10 000 Ед/мл | 100 мг/мл |
| ФБС | Н/Д | 10% |
| Среда раннего преобразования нейронов (ENM) | |
| Среда нейронной дифференцировки | Н/Д | Н/Д |
| Пенициллин/стрептомицин | 10 000 Ед/мл | 100 мг/мл |
| CHIR99021 | 10 мМ | 2 мкМ |
| СБ-431542 | 20 мМ | 10 μМ |
| башка | 100 мкг/мл | 0,5 мкг/мл |
| ЛДН-1931189 | 10 мМ | 0,5 мкМ |
| ВПА | 1 М | 1 мМ |
| ЛМ-22А4 | 20 мМ | 2 мкМ |
| ГДНФ | 20 мкг/мл | 2 нг/мл |
| НТ3 | 10 мкг/мл | 10 нг/мкл |
| db-cAMP | 50 мМ | 0,5 мМ |
| Среда позднего преобразования нейронов (LNM) | |
| Среда нейронной дифференцировки | Н/Д | Н/Д |
| Пенициллин/стрептомицин | 10 000 Ед/мл | 100 мг/мл |
| ЛМ-22А4 | 20 мМ | 2 мкМ |
| ГДНФ | 20 мкг/мл | 2 нг/мл |
| НТ3 | 10 мкг/мл | 10 нг/мкл |
| db-cAMP | 50 мМ | 0,5 мМ |
