Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка к нарезке
- Приготовьте среду для обработки тканей и среды для поддержания культуры среза за день до запланированной резекции опухоли и забора тканей (или используйте ранее созданные среды в течение 2 недель). Добавьте 5 мл раствора пенициллин-стрептомицина (10 000 Ед/мл) и 5 мл 1 М 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES) к 500 мл модифицированной среды Eagle (DMEM) Дульбекко с высоким содержанием глюкозы для получения среды для обработки тканей.
- Приготовьте 250 мл среды для поддержания культуры срезов с использованием основы нейронной среды (например, нейробазала) без фенолового красного. Добавьте в эту среду 10 мМ HEPES, 1x добавку B-27, 400 μM L-глутамина, 600 μM L-аланил-L-глутамина дипептида, 60 Ед/мл пенициллина, 60 мкг/мл стрептомицина и 6 Ед/мл нистатина.
- Хранить все среды при температуре 4 °C не дольше 2 недель.
2. День операции: получение тканей
- В день забора тканей приготовьте 50 - 100 мл 1% и 2% (масс./об.) растворов агарозы низкой температуры плавления в среде для обработки тканей с использованием автоклавной стеклянной посуды и стерильной техники в ламинарном проточном колпаке. Обе концентрации агарозы необходимы для того, чтобы приспособиться к непредсказуемым изменениям консистенции опухолевой ткани.
- Нагрейте агарозную суспензию, используя микроволновую печь, до тех пор, пока не будет наблюдаться мягкое кипение. Поместите раствор агарозы на водяную баню при температуре 37 °C для поддержания в жидком состоянии до использования.
- Поместите 1 мл среды для поддержания культуры срезов в каждую лунку 6-луночного планшета.
- С помощью стерильных щипцов поместите пустые вкладыши для культуры политетрафторэтилена (ПТФЭ) в каждую лунку. Поместите планшет во влажный инкубатор с водяной рубашкой и культурой тканей с атмосферой 5%CO2, поддерживаемой на уровне 37 °C.
- Используя стерильную дозатор Пастера в ламинарном проточном колпаке, нагнетайте смесь 95% O2/5% CO2 в колбу, содержащую среду для обработки ледяных тканей, в течение примерно 15–30 минут, прежде чем она будет захвачена опухолевой тканью. Использование надоксигенированных сред сводит к минимуму гипоксию в объемных тканях при обработке.
- Подготовьте меченые конические пробирки объемом 50 мл (достаточно для выделения желаемого количества отдельных областей опухоли), содержащие 20 мл аликвот сверхнасыщенных кислородом сред для обработки ледяного льда, для транспортировки ткани между операционной и установкой для слайсования.
- Совместно с нейрохирургом перед операцией спланируйте область опухоли для получения образца. Выберите область опухоли с контрастным усилением, как показано на клинической визуализации пациента (последовательности магнитно-резонансной томографии (МРТ) T1 после гадолиния). Предыдущий опыт показывает, что эта область дает жизнеспособную опухолевую ткань, в отличие от некротической ткани.
заметка: Была предпринята попытка получения срезов из окружающего (перитумолевого) белого вещества; Однако фоновая автофлуоресценция и снижение плотности опухолевых клеток ограничивали экспериментальную полезность этих срезов.
- Получите опухолевую ткань к началу резекции опухоли. Избегайте сбора опухолевой ткани при обширном биполярном прижигании, которое может нарушить жизнеспособность тканей на фоне термической травмы. Образцы тканей, полученные во время частичной резекции опухоли, демонстрируют повышенную жизнеспособность по сравнению с тканями, полученными в результате длительных резекций en bloc. Это наблюдение может быть связано с дифференциальной депривацией опухолевой ткани кровотока в результате хирургической резекции и увеличенным временем приобретения.
- При желании пометьте и храните опухолевую ткань в отдельных конических пробирках, чтобы выделить образцы из отдельных областей опухоли. (т.е. поверхностная или глубокая опухолевая ткань). Точное расположение тканей может быть зарегистрировано, если/когда доступна интраоперационная хирургическая навигация.
3. Подготовка культуры ломтиков
- Поместите кусочки опухолевой ткани в чашку Петри с ледяной средой для обработки. Чтобы промыть опухолевую ткань и свести к минимуму прилипшие эритроциты, с помощью пипетки аккуратно замените и отбросьте среду в чашке Петри три раза.
- С помощью скальпеля разрежьте кусочки опухоли на прямоугольные коробки. Обрежьте кусочки салфетки примерно до 3 мм x 3 мм x 10 мм. Осторожно удалите все прикрепленные сосуды путем иссечения или мягкого вытяжения с помощью тонких щипцов.
- Пипетка 5 - 7 мл 37 °C агарозой в небольшую кубообразную (~ 2 см3) пластиковую форму для встраивания. Перед применением стерильным термометром подтвердить температуру агарозного раствора не выше 37 °С.
- Дайте агарозе постоять примерно 1 минуту на подушке со льдом.
- Поместите 2 - 4 "полоски" опухолевой ткани в агарозу с длинной осью, ориентированной вертикально. заметка: Тканевые полоски будут иметь тенденцию «тонуть» в агарозе до застывания. Чтобы избежать этого осложнения, временно удерживайте полоску ткани в вертикальном положении до дальнейшего затвердевания агарозы.
- Подержите ткань, содержащую агарозную плесень, на подушке со льдом в течение 2 - 5 минут, чтобы способствовать затвердеванию.
- Снимите плесень со льда и аккуратно снимите агарозный блок, разрезав скальпелем боковые стороны формы. Избегайте приложения чрезмерного усилия к блоку, так как это может привести к поломке агарозы.
- С помощью обильной капли цианоакрилатного клея прикрепите агарозный блок к вибратомной пластине образца. Дайте клею застыть примерно 1 - 2 минуты.
- Заполните резервуар вибратома ледяным фильтрующим материалом, чтобы погрузить агарозный блок, прикрепленный к пластине образца.
- Во время нарезки пузырьки с 95% O2 / 5% CO2 газовой смесью в резервуаре вибратома через обрезанную стерильную пластиковую пипетку.
- Установите толщину среза вибратома на 300 - 350 μм.
- Отрегулируйте скорость продвижения лезвия и амплитуду лезвия в соответствии с консистенцией ткани. «Более жесткая» ткань глиобластомы требует более медленной скорости продвижения лезвия и более высокой амплитуды. Точные настройки скорости и амплитуды лезвия зависят от характеристик вибратома.
заметка: Во время нарезки обычно возникает несколько проблем. Если полоска ткани отходит от агарозного блока, попробуйте ввести ткань в агарозу более высокой концентрации. Если срезы опухоли толще, чем хотелось бы (машинная установка), или асимметричны, увеличьте амплитуду и уменьшите скорость вибратомного лезвия. Чтобы убедиться, что опухолевая ткань не прилипает к держателю лезвия и не «тянется» за него, когда происходит срез, осторожно расположите микрошпатель между держателем лезвия и срезом при движении лезвия.
- Переложите срезы тканей в чашку Петри с ледяной рабочей средой с помощью микрошпателя из нержавеющей стали.
- Получите из инкубатора 6-луночные планшеты, содержащие вкладыши из ПТФЭ и уравновешенные среды для срезов (как приготовлено в разделе 2, шаге 4).
- Срезы ткани пластины с помощью микрошпателя из нержавеющей стали. Сведите к минимуму прямой контакт и манипуляции с тканями, используя маленькую кисть с тонкой щетиной, чтобы создать «волну жидкости», чтобы аккуратно вытолкнуть срез из шпателя на вставку для культуры.
заметка: Сведите к минимуму количество рабочей среды, вводимой поверх вкладыша для культуры тканей. Если происходит перенос чрезмерного количества среды, в результате чего ломтики всплывают, используйте стерильную дозатор Пастера для удаления среды.
- Верните 6-луночные планшеты, содержащие срезы опухолей, в инкубатор, где поддерживается температура 37 °C и атмосфера 5%CO2><.
заметка: Весь протокол встраивания и среза должен быть завершен в течение 90 минут после забора опухолевой ткани из операционной.
4. Обслуживание культуры слайсов
- Через 12 - 24 ч перенесите срезы, захватив каждый ободок вставки стерильными щипцами, и переложите в планшеты, содержащие свежие среды для поддержания культуры срезов. Убедитесь, что среда для поддержания культуры срезов, аликвотированная в каждую лунку, уравновешивается в инкубаторе не менее 15 минут перед переносом вкладышей.
- Перемещайте вкладыши на новые 6-луночные планшеты со свежими уравновешенными питательными средами для срезов каждые 48 часов.
- При желании используйте питательные среды для старых срезов с помощью пипетки для немедленного использования в биохимических анализах или заморозьте при температуре -80 °C для дальнейшего использования.
