Разработка модели трехклеточной культуры гематоэнцефалического барьера человека

Аннотация

Источник: Fattakhov, N., et al. Модель тройной первичной клеточной культуры гематоэнцефалического барьера человека для изучения ишемического инсульта in vitro. J. Vis. Exp.(2022)

Это видео демонстрирует совместное культивирование перицитов человеческого мозга, астроцитов и эндотелиальных клеток. Каждый слой клеток формируется отдельно, а затем культивируется вместе, создавая трехслойную систему, которая имитирует клеточное расположение гематоэнцефалического барьера

Протокол

1. Настройка модели тройной клеточной культуры ГЭБ

1. Посев перицитов
   1. Культивировать HBVP (сосудистые перициты головного мозга человека) в колбах для культуры T75 с активированной поверхностью для адгезии клеток в инкубаторе с 5%_CO2 при температуре 37 °C до слияния. Как только слияние будет достигнуто, аспирируйте старую перицитарную среду и промойте клетки 5 мл теплого фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS). Аспирируйте DPBS и отделите клетки от колбы, используя комбинацию из 4 мл теплого раствора трипсина-ЭДТА и 1 мл DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования проходов позже P7.
   2. Инкубировать колбу в течение 5 минут при температуре 37 °C в инкубаторе с_CO2. Посмотрите под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки отделены от колбы. Добавьте в колбу 5 мл теплой перицитарной среды (содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки [FBS]) и перенесите отделенные клетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
   3. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 3 мин при 200 × г, позволяя клеткам образовать гранулу на дне пробирки. Отсасывайте среду из пробирки, гарантируя, что клеточная гранула останется неповрежденной.
   4. Ресуспендируйте клеточную гранулу в перицитарной среде; рассчитайте количество среды в зависимости от слияния клеток и количества необходимых вставок. Возьмите 10 мкл ресуспендированных клеток, поместите их в предметное стекло и подсчитайте количество клеток.
   5. Определите плотность клеток и затравите 300 000 клеток/вставку, в 1 мл перицитарной среды на алюминальную сторону луночных вставок (формат 6 лунок).
      заметка: При посеве HBVP на нижнюю сторону вкладышей важно перевернуть пластины колодца-вкладыша вверх дном. Пока пластина лежит на поверхности, снимите нижнюю часть, чтобы обнажить алюминиевую сторону вставок лунки. Накройте луночные вставки перевернутой пластиной после добавления суспензии перицитарных клеток на алюминальную сторону, чтобы предотвратить испарение. Храните все тарелки перевернутыми вверх дном в инкубаторе с 5%_CO2 при температуре 37 °C в течение ночи.
2. Посев астроцитов
   1. Культивируйте HA (человеческие астроциты) в колбах T75 в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C до тех пор, пока не будет достигнуто слияние. Выполните описанные выше шаги 1.1.1-1.1.4 с использованием астроцитарной среды (также содержащей 2% FBS) вместо перицитарной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования проходов позже P9.
   2. Определите плотность клеток и затравите 300 000 клеток/лунку на дно тканевой культуры 6-луночными планшетами. Накройте пластину крышкой, чтобы предотвратить испарение, и держите все пластины в инкубаторе с 5%_CO2 при температуре 37 °C в течение ночи.
3. Посев эндотелиальных клеток
   1. Культивируйте HBMEC (микрососудистые эндотелиальные клетки человеческого мозга) в чашках для культивирования тканей в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C до слияния. Выполните описанные выше шаги 1.1.1-1.1.4 с использованием полной классической среды (содержащей 10% FBS) вместо перицитарной среды.
      заметка: Избегайте использования проходов позже P12.
   2. Извлеките 6-луночные планшеты для тканевой культуры, содержащие астроциты, и вкладыши (6-луночного формата), содержащие перициты, из инкубатора с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °С. Аспирируйте среду астроцитов из 6-луночных планшетов для тканевой культуры. Добавьте в каждую лунку по 1 мл перицитарной среды и по 1 мл астроцитарной среды.
   3. Аспирируйте перицитарную среду из луночных вставок и поместите ее в тканевые культурные 6-луночные планшеты, содержащие засеянные астроциты. Затравить HBMEC плотностью 300 000 клеток/лунку в 2 мл полной классической среды на апикальную сторону тех же вставок лунок.
      заметка: Эндотелиальные клетки должны быть засеменены на апикальной стороне луночных имплантатов на следующий день после посева перицитов на абуминальной стороне луночных вкладышей и астроцитов на 6-луночных планшетах для культуры тканей. Клетки следует поддерживать в тройной культуре в течение шести дней, чтобы индуцировать BBB-подобные свойства. Среду для культивирования клеток следует менять в обоих отсеках для лунок за 24 часа до эксперимента.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Transwell 24 мм со вставкой из полиэфирной мембраны 0,4 мкм	Корнинг	No 3450
Тарелки со стеклянным дном 35 мм	MatTek Медико-биологические науки (FISHERSCI)	П35ГК-1.5-14-С
Астроцитарная среда	Научная ячейка	1801 г
Фактор привязанности	Клеточные системы (Fisher Scientific)	4З0-201
Комплексная классическая среда с сывороткой и CultureBoost	4Z0-500	Клеточные системы
Центрифужные пробирки Corning 50 мл из полипропилена (коническое дно с крышкой CentriStar	ВВР	430829
Corning 75 см² U-образная колба с наклонной шейкой без обработки клеточных культур	Корнинг	431464У
Corning CellBIND 96-луночные плоские микропластины из черного полистирола с прозрачным дном	Корнинг	No 3340
Горки камеры подсчета клеток Countes	Thermo Fisher Scientific	С10228
Countess II FL Автоматизированный счетчик ячеек	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Среда DMEM (без глюкозы, без глютамина, без фенола красного)	ТермоФишер	А14430-01	Среда без глюкозы
DPBS (без кальция, без магния)	ТермоФишер	14190250
EBM Endothelial Cell Growth Базальная среда, фенол красный без фенола, 500 мл	Лонза	СС-3129
CO2-инкубатор
центрифуга