$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Синтез желатина метакрилоила (GelMA)
- Взвесьте 10 г желатина, полученного из свиной кожи, и растворите в 100 мл PBS, дав раствору помешать на нагревательной пластине при 240 об/мин и 50 °C до полного растворения.
- Под колпак добавьте 2 мл метакрилового ангидрида (MA) для низкой степени функционализации и дайте желатиновой эмульсии перемешаться при 240 об/мин и 50 °C в течение 2 ч.<бр/>
осторожность: Заявление об опасности MA: H302 + H332 (вреден при проглатывании или вдыхании), H311 (токсичен при контакте с кожей), 314 (вызывает серьезные ожоги кожи и повреждение глаз), 315 (вызывает раздражение кожи), H317 (может вызвать аллергическую реакцию кожи), H318 (вызывает серьезное повреждение глаз), 331 (токсичен при вдыхании), H332 (вреден при вдыхании), H335 (может вызвать раздражение дыхательных путей). Рекомендации по обращению: P261 (избегайте вдыхания пыли/дыма/газа/тумана/паров/аэрозоля), P305 + P351 + P338 + P310 (ПРИ ПОПАДАНИИ В ГЛАЗА: Осторожно промойте водой в течение нескольких минут. Снимите контактные линзы, если они есть и их легко сделать. Продолжайте полоскание. Немедленно позвоните в ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР/врачу), P301 + P312 + P330 (ПРИ ПРОГЛАТЫВАНИИ: Позвоните в ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР/врачу, если вы чувствуете себя плохо. Прополощите рот).
заметка: Добавляйте MA очень медленно, капля за каплей.
- Раствор желатина-MA разбавить в 100 мл предварительно нагретого PBS (50 °C) до получения 200 мл конечного объема и дать раствору перемешаться при 240 об/мин и 50 °C в течение 10 минут.
- Отрежьте ~20 см диализной мембраны (молекулярный предел 12-14 кДа) и замочите ее в деионизированной воде, пока она не станет мягкой><.
заметка: Заполните мембраны деионизированной водой, чтобы убедиться в отсутствии отверстий или дефектов.
- С помощью воронки перенесите раствор желатина-МА на мембраны.<бр/>
заметка: Закройте обе стороны, оставив дополнительное пространство внутри, чтобы смешаться.
- Поместите мембраны, содержащие раствор желатина-MA, в емкость с 2 л дистиллированной воды для диализа и дайте им помешать при 40 °C в течение 5 дней (500 об/мин).
заметка: Накройте емкость крышкой, чтобы избежать испарения воды.
- Меняйте дистиллированную воду два раза в день. Каждый раз переворачивайте мембраны вверх дном для гомогенизации.
- На пятый день смешайте 200 мл предварительно подогретой сверхчистой воды (40 °C) с диализованным желатином-MA и перемешивайте в течение 15 минут при 40 °C.
- Перелейте раствор желатина-MA в конические пробирки объемом 50 мл до 25 мл и оставьте пробирки при температуре -80 °C в течение 2 дней.
заметка: Храните пробирки горизонтально, чтобы облегчить лиофилизацию.
- Лиофилизируйте замороженные растворы в течение 3-5 дней и храните лиофилизированный ГельМА в защищенном от влаги месте.
2. Подготовка Bioink
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить 1 мл биочернил, рекомендуется изготовить не менее 3 мл раствора биоматериала, так как при фильтрации могут быть потери.
- Приготовление раствора фибриногена
- В деионизированной воде приготовьте солевой раствор (NaCl 0,9%) и растворите 10 мг фибриногена из плазмы крупного рогатого скота в 1 мл солевого раствора до получения концентрации 10 мг/мл.<бр/>
заметка: Так как фибриноген адсорбируется на стекле, не стоит использовать стеклянные колбы для приготовления раствора фибриногена.
- Оставьте раствор в перемешивании при температуре 37 °C до полного растворения фибриногена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для растворения фибриногена используйте вращающуюся систему, помещенную в печь при температуре 37 °C. Также подходит магнитное перемешивание (180 об/мин) фибриногена на горячей плите при 37 °C. При этом условии для растворения фибриногена 10 мг/мл требуется примерно 40 минут.
- Приготовление раствора желатина/гелМА
- Взвесьте 0,12 г желатина и добавьте его к 1,9 мл предварительно нагретого PBS (40 °C) до получения конечной концентрации 4% (w/v) желатина. Вортекс для облегчения растворения.
- Держите эмульсию при температуре 40 °C до полного растворения.
- Взвесьте 0,06 г лиофилизированного GelMA и перенесите его в раствор желатина до получения конечной концентрации 2% (w/v) GelMA. Вортекс для облегчения растворения.
- Выдерживайте раствор при температуре 40 °C до полного растворения.
3. Получение астроцитов из желатина/GelMA/фибриногена bioink
- Пипеткой впрыскивают 0,9 мл раствора фибриногена 10 мг/мл и переносят в раствор желатина/ГельМА до получения конечной концентрации фибриногена 3 мг/мл.
- Взвесьте 0,015 г фотоинициатора (PI) и перенесите в раствор желатина/GelMA/фибриногена до получения конечной концентрации 0,5% (w/v) PI. Перемешайте раствор, переворачивая трубку вверх и вниз, и держите ее при температуре 40 °C в защищенном от света месте, чтобы избежать ухудшения качества ПИ.
заметка: Храните биочернила при температуре 4 °C не более чем на 24 часа.
- Под ламинарным потоком отфильтровать раствор с помощью фильтра 0,2 мкм в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл.
заметка: Раствор биоматериала должен быть при температуре 37-40 °C для обеспечения фильтрации.
- Перенесите 980 мкл раствора биоматериала в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Разведите ламинин в солевом растворе до получения стокового раствора 100 мкг/мл.
- Пипеткой внесите 20 мкл ламинина и перенесите в пробирку, содержащую биочернила, до получения конечной концентрации 2 мкг/мл ламинина.
- Осторожно перемешивайте, пипетируя вверх и вниз, избегая образования пузырьков. Если пузырьки сохраняются, центрифугируйте коническую пробирку при давлении 200 x g в течение 2 минут. Держите биочернила при температуре 37 °C до тех пор, пока они не смешаются с клетками.
- Трипсинизировать первичные астроциты 0,05% трипсином в течение 5 мин.<бр/>
заметка: Используйте астроциты из проходов с 1 по 3.
- Нейтрализуйте активность трипсина с помощью FBS в соотношении 1:1 и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте его при 200 х г в течение 5 минут.
- Подсчитайте ячейки и перенесите 1 x 106 ячеек в другую коническую трубку. Центрифугируйте его при 200 х г в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость, оставив небольшой объем (~200 μл) для суспензии клеточной гранулы, осторожно постукивая по дну конической трубки.
- Перенесите 1 мл раствора желатина/GelMA/фибриногена в пробирку, содержащую клетки, и осторожно пипетируйте вверх и вниз для гомогенизации, получая конечную концентрацию 1 x 106 клеток/мл.
3. Приготовление решения для сшивающего агента
- Восстановление тромбина
- Приготовьте стоковый раствор тромбина 100 Ед/мл в стерильной деионизированной воде с 0,1% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (БСА) в конической пробирке объемом 15 мл. Запас в микропробирках при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку тромбин адсорбируется на стекле, не используйте стеклянные колбы для приготовления исходного раствора или хранения аликвот.
- Приготовление раствора тромбина-CaCl2
- Пипеткой ввели 100 мкл стокового раствора тромбина и переложили в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 8,9 мл стерильной деионизированной воды, до получения конечной концентрации 1 Ед/мл тромбина.
- Приготовьте 10% раствор CaCl2 в деионизированной воде и простерилизуйте с помощью фильтра 0,2 мкм.
- Переведите 1,1 мл 10% раствора CaCl2 в коническую трубку, содержащую тромбин, чтобы получить окончательное соотношение 1:9 (CaCl2 к тромбину).
заметка: Приготовьте раствор сшивающего агента в объеме для эксперимента, избегая хранения.
4. Биопечать биочернил, насыщенных астроцитами, с использованием биопринтера на основе экструзии
- Дизайн нервной ткани
- Используя G-код: постройте сетку размером 6 x 6 мм (квадратная форма) с расстоянием 1 мм между каждой линией биопечати по осям X и Y и 6 слоями по оси Z (0,2 мм между каждой линией); установите экструзию (E) на 0,01 мм, увеличивая 0,001 мм с каждым новым слоем оси Z; и установите скорость печати (F) на 400 мм/мин (дополнительная информация).
- Настройка биопринтера
- Подвергните машину воздействию ультрафиолетового излучения в течение 15 минут, а затем протрите ее этанолом 70%.
- Включите биопринтер с помощью выключателя питания. Подключите аппарат к компьютеру с помощью USB-кабеля. Откройте управляющее программное обеспечение, чтобы подключить его к биопринтеру и загрузить файл дизайна.
- Приготовление шприца для биопечати
- Перенесите насыщенные астроцитами желатин/GelMA/фибриноген биочернила в пластиковый шприц объемом 5 мл с помощью пипетки объемом 1000 мкл.
заметка: Перекладывайте медленно, чтобы избежать образования пузырьков.
- Подсоедините к шприцу стерильную тупую иглу 22 G.
заметка: Оставьте шприц при температуре 4 °C на 2 минуты.
- Подсоедините шприц к печатающей головке биопринтера и вручную промойте биочернила, чтобы удалить оставшиеся пузырьки.
- Биопечать
ПРИМЕЧАНИЕ: Биопечать проводилась вне ламинарного колпака.
- Поместите чашку для культур диаметром 35 мм на стол биопринтера и расположите иглу на расстоянии 0,1 мм от поверхности чашки для культур, чтобы игла могла перемещаться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одну чашку для культуры диаметром 35 мм для каждой биопечати.
- Нажмите кнопку «Печать».
- После того, как биопечать будет завершена, убедитесь, что шприц отошел от чашки. Затем закройте чашку для культивирования и подготовьтесь к процессу сшивания.
заметка: Биопечать одного конструкта занимает примерно 1 мин и 10 с.
- Сшивание биопечатного конструкта и культуры
- Поместите чашку для культивальных культур под ультрафиолетовое излучение со скоростью 2 мВт/см2 на 2 x 60 с (вверх и вниз) для сшивания GelMA.
- Под ламинарным потоком перенесите бионапечатанную конструкцию на 24-луночный планшет с помощью стерильного шпателя.
- Добавьте 500 μL раствора тромбина/CaCl2 и оставьте на 30 минут, чтобы обеспечить сшивание фибрина.
- Удалите сшивающий раствор и промойте конструкцию 2 мл PBS 1x. Затем замените PBS 1 мл питательной среды для астроцитов и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2. Меняйте среду каждые 3 дня.