Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Тиолирование гиалуроновой кислоты
ПРИМЕЧАНИЕ: Молярные отношения указываются относительно общего числа карбоксилатных групп, если не указано иное.
- Растворите 500 мг гиалуроната натрия (ГК, 500-750 кДа) в концентрации 10 мг/мл в деионизированной дистиллированной воде (DiH2O) в стерилизованной автоклавной колбе Эрленмейера объемом 250 мл. Перемешайте раствор (~200 об/мин) при комнатной температуре в течение 2 часов до полного растворения ГК. Используйте мешалку и магнитную мешалку, чтобы поддерживать реакцию перемешивания во время процедуры тиолирования.
- Используя 0,1 М соляной кислоты (HCl), отрегулируйте pH раствора ГК до 5,5. Дозируйте 69,6 мг (0,25x молярное отношение) 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимимида (EDC).
заметка: Несмотря на то, что нерастворенный EDC можно добавлять непосредственно в раствор HA, обычно проще сначала растворить EDC в 1 мл DiH2O, а затем быстро добавить раствор EDC в раствор HA. Предварительное растворение в 1 мл DiH2O также может быть выполнено с помощью N-гидроксисукцинимида (NHS) и цистаминдигидрохлорида перед добавлением в реакцию на этапах 1.3 и 1.4.
- Добавьте в реакцию 17,9 мг (0,125x молярное отношение) NHS. Отрегулируйте pH реакционного раствора до 5,5 с помощью 0,1 М HCl и инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение 45 минут.
- Добавьте 70,0 мг (0,25х молярного отношения) цистаминдигидрохлорида в реакционный раствор. Используйте 0,1 М гидроксида натрия (NaOH) для регулировки pH до 6,25. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение ночи при помешивании.
- На следующий день используйте 1 М NaOH, чтобы довести pH реакционного раствора примерно до 8. Добавьте 192 мг (4-кратное молярное соотношение) дитиотреитола (DTT) в реакцию. Отрегулируйте pH до 8 после добавления DTT и оставьте перемешивание на 1-2 часа при комнатной температуре.
- Используйте 1 М HCl для регулировки pH до 4. Перенесите всю реакционную смесь в предварительно замоченную диализную мембрану (отсечка молекулярной массы около 13 кДа) и диализируйте против DiH2O, предварительно отрегулированного до pH 4,
заметка: Объем DiH2O для диализа должен быть не менее чем в 40 раз больше объема прореагировавшего раствора ГК (например, 50 мл образца на 2 л DiH2O, pH 4).
- Заменяйте диализный раствор (DiH2O, pH 4) два раза в день в течение 3 дней при комнатной температуре.
- Отфильтруйте диализованный раствор через мембранный вакуумный фильтр толщиной 0,22 мкм. Раствор мгновенной заморозки тиолированной ГК в жидком азоте. Используйте лиофилизатор для сублимационной сушки образцов в течение 2 дней. Тиолированная гиалуроновая кислота в сухом виде может храниться в вакуумном эксикаторе при температуре -20 °C не менее 6 месяцев.
- Для определения степени тиолирования используйте тест Эллмана и/или протонную ЯМР-спектроскопию.
2. Подготовка материалов для сшивки
- Растворите тиолированную ГК в желаемой концентрации (в данном примере 13,3 мг/мл) в физрастворе, буферизованном по шкале HEPES (20 мМ HEPES в сбалансированном солевом буфере Хэнка (HBSS), отрегулированном так, чтобы он находился в пределах pH 8-9) в янтарном флаконе, чтобы свести к минимуму воздействие окружающего света. Держите раствор в постоянном помешивании.
заметка: Образование дисульфидных связей между тиолами, сопряженными с ГК, может происходить, если pH выше 8, концентрация раствора слишком высока или раствор слишком долго перемешивается перед гелеобразованием. Чтобы избежать этой проблемы, используйте менее 15 мг/мл тиолированной ГК и растворите тиолированную ГК в течение 2 часов после образования гидрогелей.
- Растворите 4-групповой ПЭГ-малеимид (ПЭГ-Mal, 20 кДа) и 4-групповой ПЭГ-тиол (ПЭГ-тиол, 20 кДа) в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,4, для получения 50 мг/мл ПЭГ-Mal и стоковых растворов ПЭГ-тиола.
заметка: Для полного растворения реагентов ПЭГ требуется не менее 1 часа.
- При добавлении пептидов, полученных из ВКМ, растворите цистеинсодержащие пептиды в PBS для получения исходного раствора.
заметка: Используйте исходную концентрацию 2-4 мМ.
- Замочите формы из силиконовой резины в этаноле не менее чем на 20 минут, чтобы очистить их, а затем автоклавировать для стерилизации.
3. Гидрогелевое сшивание и инкапсуляция клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера здесь описана инкапсуляция четырех отдельных гидрогелей объемом 80 мкл с 0,5% (w/v) HA и модулем сжатия 1 кПа3. См., например, в таблице 1 приведены рецепты, в которых получаются гидрогели с различными свойствами: два гидрогеля с интегрин-связывающим пептидом RGD и два гидрогеля с цистеиновыми капсюлями в качестве отрицательного контроля активности пептида. Посевная концентрация клеток GBM, полученных от пациента, составляет 500 000 клеток/мл.
- Разбавляют стоковый раствор PEG-Mal (50 мг/мл, начиная с шага 2.2) до 12,5 мг/мл путем добавления 40 мкл исходного раствора к 120 мкл PBS. Разбавленный раствор разделите на две микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, каждая по 80 мкл.
- Добавьте 16 мкл исходного раствора РГД (2,8 мМ, начиная с шага 2.3) в одну пробирку и 16 мкл исходного раствора цистеина (2,8 мМ, начиная с шага 2.3) во вторую пробирку. Вихрь перемешать. Поместите растворы PEG-Mal-RGD или PEG-Mal-CYS на лед до использования на шаге 3.9.
заметка: Описанная здесь процедура позволяет получить гидрогели с ~140 мкМ пептида. Это эквивалентно примерно 1 из каждых 8 доступных групп ПЭГ, занятых пептидом. Это может быть изменено путем изменения молярного соотношения пептидов с цистеин-концом к доступным малеимидным группам. В целом, максимальная концентрация пептида в 280 мкМ может быть достигнута, при этом остается достаточное количество малеимидных групп, доступных для гидрогелевого сшивания.
- Разбавьте стоковый раствор ПЭГ-тиола (50 мг/мл, начиная со стадии 2.2) до 5 мг/мл, смешав 4 мкл стокового раствора 50 мг/мл с 36 мкл PBS. Добавьте в смесь 120 мкл растворенной, тиолированной гиалуроновой кислоты из стадии 2.1.
заметка: Растворы HMW HA очень вязкие. Таким образом, мы рекомендуем использовать наконечник микропипетки с широким отверстием для переноса растворов. Делайте пипетку медленно, чтобы избежать прилипания раствора к стенкам наконечника микропипетки и повысить точность измерения.
- Поместите чистые сухие формы (подготовленные на шаге 2.4) в каждую лунку 12-луночного планшета, не обработанного тканевой культурой. Используя чистый тупой конец наконечника для пипетки, нажмите на гелевую форму и еще раз проверьте герметичность между формами и дном луночной пластины.
заметка: Проверьте уплотнение еще раз непосредственно перед герметизацией, чтобы предотвратить утечку.
- Пассаж культивируемых GBM-клеток, диссоциацию на одиночные клетки и определение концентрации клеток, как описано ранее3,
заметка: Некоторые линии GBM не могут быть разделены на отдельные ячейки. В этом случае могут быть инкапсулированы целые глиомасферы. Тем не менее, подготавливайте диссоциированные одиночные клетки после точного подсчета клеток для улучшения воспроизводимости. Протокол пропускания глиомасферы варьируется в разных лабораториях, и многие из них, вероятно, совместимы с гидрогелевой инкапсуляцией.
- (Рекомендуется) Центрифугируйте глиомасферы при давлении 500 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл фермента диссоциации клеток в клеточную гранулу. Затем инкубируйте в течение 5 минут, осторожно постукивая по трубке для взбалтывания.
- Добавьте в клетки 4 мл полной питательной среды (50 нг/мл EGF, 20 нг/мл FGF-2, 25 мкг/мл гепарина, добавку G21 и 1% пенициллин/стрептомицин в DMEM/F12).
- Снова центрифугируйте при 500 х г в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость. Наконец, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл готовой среды и пропустите взвешенные клетки через сетчатое фильтр 70 мкм. (Рекомендуется) промойте ситечко еще 4 мл готовой среды, чтобы максимально увеличить количество восстанавливаемых клеток.
- Оцените концентрацию клеток в суспензии с помощью гемоцитометра. Разделите клеточную суспензию на 2 центрифужные пробирки, где каждая пробирка содержит ~80 000 клеток. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин; как правило, 80 000 клеток составляют 2 80 мкл гидрогелей.
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте одну гранулу в 80 мкл раствора PEG-MAL-RGD и вторую гранулу в 80 мкл раствора PEG-MAL-CYS (приготовленного на шаге 3.1).
- С помощью наконечника для микропипетки с широким отверстием объемом 200 мкл нанесите 40 мкл раствора ГК (из шага 3.3 выше) в каждую резиновую силиконовую форму (как приготовлено на шаге 3.4).
- С помощью наконечника для микропипетки с широким отверстием объемом 200 мкл смешайте 40 мкл клеточного раствора PEG-MAL-CYS или PEG-MAL-RGD с раствором ГК в форме. Быстро проводите пипеткой вверх и вниз не более 10 раз. Повторите для каждой готовящейся гелевой культуры.
заметка: Этот этап требует практики, так как первоначальное гелеобразование происходит быстро (в течение 30 с). Проводите пипеткой вверх и вниз, перемещая наконечник в разные места в формах, чтобы обеспечить равномерное перемешивание. Всегда держите наконечник ниже уровня жидкости, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Не перемешивайте раствор слишком много раз, так как внутри наконечника микропипетки может образоваться гель. PEG-MAL-CYS и PEG-MAL-RGD можно комбинировать в различных соотношениях для достижения желаемой концентрации пептида RGD.
- Поместите луночный планшет, содержащий инкапсулированные гелем клетки, в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 °C на 5-10 минут, чтобы обеспечить завершение реакции.
- Добавьте по 2-2,5 мл питательной среды в каждую лунку с образовавшимися гелями. С помощью стерильного наконечника для пипетки объемом 2 мкл или микрошпателя аккуратно отделите форму и гель. С помощью предварительно стерилизованных щипцов удалите форму из лунной пластины. Поместите луночный планшет обратно в клеточный инкубатор (37 °C и 5%CO2) для культивирования и будущих экспериментов.
заметка: Потяните форму вертикально вверх, чтобы не повредить гелевые культуры. В целом, среду в гелевых культурах следует заменять каждые 3-4 дня. Следите за тем, чтобы не аспирировать гидрогели при удалении среды. Если это проблема, мы рекомендуем использовать пластиковую переводную пипетку. Если планируется биолюминесцентная визуализация для отслеживания количества клеток, клетки GBM должны быть трансдуцированы лентивирусом, кодирующим конститутивную экспрессию люциферазы, перед инкапсуляцией, как описано ранее3. Для биолюминесцентной визуализации добавьте 1 мМ D-люциферина в культуральную среду за 1 ч до люминесцентной визуализации.
