1. Подготовка перед культурами органотипических срезов мозжечка
- В колпаке для клеточных культур, предварительно распыленном 70% этанолом, приготовьте 200 мл питательной среды в вакуумном фильтре объемом 250 мл на крышке бутылки, прикрепленном к стерильному ресиверу для бутылок. Добавьте 100 мл базального среднего орла (BME), 50 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS), 50 мл инактивированной при нагревании лошадиной сыворотки, 1 мл 200 мМ L-глутамина (конечная концентрация 1 мМ) и 5 мл 200 г/л глюкозы (конечная концентрация 5 мг/мл). Вакуумируйте питательную среду и выдержите ее при температуре +4 °C до месяца.
- В стерилизованном шкафу биобезопасности извлеките из упаковки планшет для культивирования на 6 лунок. Заполните каждую лунку 1 мл питательной среды. Если лечение испытывается, добавьте фармакологическое средство в обработанную лунку и такой же объем раствора средства для контрольной лунки. В настоящем исследовании мы добавляли 1 мкл стерильного раствора 3 М KCl в обработанную лунку (30 мМ в конечном итоге) и 1 мкл стерильной воды в контрольные лунки.
- Занесите внутрь колпака для клеточных культур необходимое количество индивидуально упакованных вставок для клеточных культур с мембраной из гидрофильного политетрафторэтилена (ПТФЭ) (размер пор = 0,4 мкм). Аккуратно разверните их и выньте стерильными щипцами вкладыши для клеточных культур. Опустите их по одному в лунку 6-луночного планшета, избегая образования пузырьков на границе между мембраной вкладыша и средой для культивирования клеток. Дайте вкладышам сбалансироваться в среде в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%CO2 не менее чем за 2 ч до культивирования.
заметка: Измельчитель тканей постоянно находится в колпаке для клеточных культур.
- Приготовьте два стакана объемом 200 мл, один из которых наполнен 150 мл стерильной воды, а другой — 150 мл 70% этанола. Перед использованием опустите хирургические инструменты в ванну с содержанием этанола 70%, а затем в воду><.
заметка: Не используйте хирургические инструменты сразу после контакта с этанолом.
- Продезинфицируйте обоюдоострое лезвие в стакане с содержанием этанола 70%. Поместите его на держатель лезвия с помощью стерильных щипцов и удерживайте на месте с помощью зажимного ключа для лезвия. Дайте ему высохнуть до использования.
- Продезинфицируйте пластиковый диск, входящий в комплект измельчителя тканей, в стакан с 70% этанолом. Распылите на стол для резки 70% этанола перед тем, как установить на него диск. Дайте высохнуть до использования.
2. Диссекция и органотипические культуры мозжечка
- Поместите мышиного щенка внутрь колпака для клеточных культур, чтобы выполнить вскрытие.
- Быстро обезглавьте щенка прямыми ножницами (Рисунок 1А).
- Держа голову щенка за нос прямыми перевязочными щипцами, разрежьте кожу головы прямыми ножницами для глаз, начиная с заднего конца и двигаясь от боковой к средней линии.
- Проделайте то же самое с черепом.
заметка: Обязательно направляйте кончики ножниц наружу, чтобы не повредить мозжечок во время вскрытия.
- Выньте мозг и перенесите его в 60-миллиметровую посуду, наполненную холодной HBSS + 5 мг/мл глюкозы.
- Аккуратно рассеките мозжечок с помощью стерильных прямых тонких щипцов (Рисунок 1Б). Перенесите его на пластиковый диск, размещенный на режущем столе измельчителя тканей, с помощью стерильных изогнутых тонких щипцов.
- Ориентируйте ткань, вращая режущий стол для выполнения парасагиттальных срезов.
- Переместите режущий стол, потянув ручку разблокировки стола вправо, чтобы лезвие располагалось на краю ткани.
- Отрегулируйте толщину ломтика до 350 μм и скорость лезвия до средней.
- Запустите измельчитель. После того, как весь мозжечок будет разрезан (Рисунок 1C), выключите измельчитель.
- Извлеките пластиковый диск с помощью стерильных щипцов.
- Осторожно поднесите пластиковый диск к 60-миллиметровой чашке, содержащей глюкозу HBSS + 5 мг/мл. Пипеткой холодно подайте HBSS + 5 мг/мл глюкозы в ткань с помощью стерильной передаточной пипетки, чтобы обеспечить забор ломтиков мозжечка в чашке, заполненной буфером.
- Отделите срезы мозжечка друг от друга с помощью микрозонда. Извлеките срезы хорошего качества с помощью переводной пипетки (рекомендуется использовать срезы тканей, расположенные близко к червеобразию) и опустите их в предварительно уравновешенную вставку для клеточной культуры (рис. 1D).
- Расположите срезы мозжечка на вставке для клеточной культуры с помощью микрозонда, затем осторожно удалите избыток раствора глюкозы HBSS + 5 мг/мл с помощью пипетки для переноса.
заметка: На этой стадии ткань чрезвычайно нежна и подвержена физическим повреждениям. Максимальное количество срезов мозжечка на одну вставку клеточной культуры зависит от возраста донорского животного. Для животного P0–P4 можно культивировать 6–8 срезов, а для животных старше P5 – 4–6 срезов.
- Поместите чашку для культуры в инкубатор, полностью меняя среду каждые 2–3 дня.
- Чтобы оценить выживаемость клеток Пуркинье, срезы могут быть собраны уже на 5 дней in vitro. Для других целей их можно выдерживать в культуре в течение нескольких недель (рис. 1F).
заметка: В случае экспериментов по выживанию клеток Пуркинье нет необходимости возобновлять фармакологическое лечение при смене среды для культивирования клеток (рис. 1F).
3. Иммунофлюоресценция
- Достаньте из инкубатора планшет на 6 лунок. Удалите питательную среду для клеточных культур, промойте вкладыш для клеточной культуры 1x PBS и зафиксируйте срезы холодным 4% раствором параформальдегида на 1 ч, при этом 1 мл под вкладыш для клеточной культуры и 500 мкл поверх вкладыша для клеточной культуры.
- Промойте вкладыши 4x 10 мин 1x PBS, 1 мл под и 500 мкл сверху, на орбитальном шейкере.
- С помощью кисточки перенесите срезы мозжечка из 1 вставки для клеточной культуры в 1 лунку из 24 лунок, предварительно заполненных 1x PBS, 0,25% Triton X-100, и 3% BSA (PBS-TB), 500 мкл/лунка.
- Пермеабилизируйте и блокируйте срезы путем инкубации в PBS-TB в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубировать с первичными антителами, разведенными в растворе PBS-TB, в течение ночи при +4 °С, на орбитальном шейкере, 200 μл/лунку.
- На следующий день выполните четыре промывки по 10 минут с 1x PBS на орбитальном шейкере, 500 μл/лунка.
- Инкубировать вторичными антителами, разведенными в растворе PBS-TB, в течение двух часов при комнатной температуре, на орбитальном шейкере, защищенном от света, 200 мкл/лунка.
- Выполните четыре промывки по 10 минут с 1x PBS, на орбитальном шейкере, 500 μл/лунка.
- Срежьте ломтики с помощью Hoechst 33342, разведенного в 1x PBS (2 мкг/мл), в течение 10 минут при комнатной температуре, в защищенном от света месте, 500 μл/лунка.
- Закрепите срезы мозжечка на предметном стекле для микроскопии с помощью переводной пипетки. Дайте им полностью высохнуть на воздухе, защищенном от света месте. Повторно увлажните их с помощью 1x PBS и наклейте покровное стекло, покрытое несколькими каплями монтажного носителя (~80 μл). Избегайте образования пузырей.
- После того, как монтажная среда отверждится, срезы мозжечка готовы к визуализации.
4. Визуализация и количественная оценка выживаемости клеток
- Включите микроскоп и лазеры в соответствии с требованиями производителя.
- Запустите программное обеспечение для сбора данных.
- Используя объектив 10X, найдите неизмененные срезы мозжечка, которые представляют собой 9–10 долек (обычно участки мозжечка, расположенные близко к червям).
- Активируйте получение z-стека. Определите диапазон z-стека, чтобы включить в него все клетки Пуркинье, присутствующие в мозжечковом срезе. Установите размер шага 2 мкм и начните сбор данных. Сохраните полученное изображение в формате производителя программного обеспечения для сбора данных, чтобы сохранить связанные метаданные.
- Откройте полученный файл в ImageJ с помощью плагина Bio-formats.
- Перейдите в раздел Изображение > Стеки > Z-проект... (Рисунок 2A).
- Выберите Max Intensity в раскрывающемся меню Тип проекции и нажмите OK (Рисунок 2B).
- Будет сгенерировано сглаженное 2-D изображение. Дважды кликните по инструменту «Многоточечный», чтобы открыть окно инструмента «Точка». Снимите отметку с опции Пометить точки, чтобы упростить визуализацию подсчитанных ячеек. Затем щелкните непосредственно на соме ячейки Пуркинье, чтобы начать подсчет (Рисунок 1E). Общее количество подсчитанных ячеек будет указано в нижней части окна Point Tool (Рисунок 3).
заметка: Как правило, можно количественно определить, по крайней мере, 3 неповрежденных участка, содержащих 9–10 долек на вставку-культуру клеточной культуры. Для оценки нейропротекторного действия фармакологического средства следует провести не менее 3 самостоятельных экспериментов.
