Диссоциация и культивирование нейронов из образцов ткани гиппокампа

Аннотация

Источник: Servello, D. et al., Микробиомеханическая система для изучения формирования и восстановления варикозного расширения вен в аксонах центральных нейронов. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует диссоциацию и культуру нейронов гиппокампа из образцов ткани гиппокампа с использованием ферментативных и механических диссоциаций. Лечение Ara-C подавляет рост ненейрональных клеток, способствуя избирательному росту нейронов гиппокампа.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Вскрытие, диссоциация и культура нейронов гиппокампа у беременной мыши/крысы

1. Диссекция и диссоциация нейронов гиппокампа для бактериологического исследования
   1. Разморозьте раствор фермента протеазы (3 мг/мл протеазы 23 в растворе для рассечения срезов, SLDS, табл. 1) и предварительно подогрейте гальванический материал (табл. 2) при 37 °С.
   2. Рассеките гиппокамп и промойте SLDS.
      заметка: Четыре гиппокампа обеспечивают достаточное количество клеток для одного 24-луночного или одного 6-луночного планшета.
   3. Удалите SLDS, добавьте 2 мл раствора фермента протеазы и инкубируйте образец при 37 °C, 5%_CO2, в течение 15 минут.
   4. Дважды промойте экспланты гиппокампа 5-10 мл плоской среды. Добавьте 5 мл гальванической среды. Диссоциировать экспланты гиппокампа на отдельные клетки путем создания небольшого вихря с помощью пипетки с пластиковым наконечником объемом 1 мл. Проводите пипеткой вверх и вниз около 40 раз, не допуская образования пузырьков кислорода, пока раствор не помутнеет и не останется крупных кусков экспланта.
      заметка: Не забывайте оставлять некоторое количество среды во время промывания, экспланты гиппокампа должны оставаться погруженными в среду в течение всего процесса.
   5. Центрифугируйте клетки при давлении 1,125 x g в течение 3 мин. Удалите надосадочную жидкость вместе с клетками, погруженными в среду. Ресуспендируйте клетки в 145 мл гальванической среды. Добавьте 1 мл/лунку клеточной суспензии в 24-луночный планшет (3 мл/лунку в 6-луночный планшет). <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: 145 мл гальванической среды используется для получения клеточной суспензии с низкой плотностью клеток. Этот объем позволит разделить ячейки на шесть 24-луночных планшетов, восемь 6-луночных планшетов или различные комбинации 24- или 6-луночных планшетов, в зависимости от проводимых экспериментов. Каждая лунка 24-луночного планшета будет иметь примерно 3 x 10⁴ ячейки.
   6. Инкубируйте клетки в гальванической среде при 37 °C, 5%_CO2 в течение 2-4 ч, затем удалите все гальванические среды и замените их свежими средами для технического обслуживания.
   7. Через 2 дня (2 дня in vitro, 2DIV) замените половину среды на 2 мкМ Ara-C (арабинозилцитозин), растворенный в поддерживающей среде, который подавляет рост фибробластов, эндотелиальных и глиальных клеток. После воздействия Ara-C на клетки в течение двух дней замените среду свежей средой для обслуживания.

Таблица 1: Решение для покрытия покровного стекла. Содержит рецепт приготовления решения для покрытия покровного стекла, используемого для приклеивания культивируемых клеток к покровным стеклам.

Решение для покрытия покровного стекла
780 мкл	Уксусная кислота17 мМ запас: 50 мкл уксусной кислоты в 50 мл H2O
200 μл	Поли-D-лизин (0,5 мг/мл бульона)
20 μл	Коллаген из крысиного хвоста (запас 3 мг/мл)
Общий объем определяется на основе количества покрывающих стекол, которые необходимо покрыть.

Таблица 2: Рецепты питательных сред для клеточных культур. Содержит рецепты для приготовления питательных сред, используемых при культивировании первичных клеток нейронов гиппокампа.

1x Раствор для рассечения срезов (SLDS), фильтрованный, pH= 7.4, хранить при 4 °C
1 л	ддН2О
82 мМ	Na2SO4
30 мМ	К2СО4
10 мМ	ГЕПЕС (свободная кислота)
10 мМ	D-глюкоза
5 мМ	MgCl2
0,00%	Фенол красный (по желанию)
Гальванический материал (PM, фильтр, хранить при 4 °C)
439 мл	MEM Соли Эрла
50 мл	ФБС
11,25 мл	20% D-глюкозы
5 мл	Пируват натрия (100 мМ,)
62,5 мкл	L-глютамин (200 мМ)
5 мл	Пенициллин/стрептомицин (/с, 100x)
Среда для обслуживания (MM, фильтр, хранение при 4 °C)
484 мл	Нейробазальный
10 мл	Доплата B27 50x
1,25 мл	L-глютамин (200 мМ)
5 мл	100-кратный P/S
Все растворы стерилизуются с помощью фильтра с размером пор 0,2 мм.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Покровные накладки 12 мм	Уорнер Инструментс	Тел.: 64-0702	Для 24-луночного планшета
Покровные стекла 25 мм	Научный центр Фишера	Тел.: 12-545-102	Для 6-луночного планшета
уксусная кислота	Научный центр Фишера	А38-212
Поли-D-лизин	сигма	П6407
Коллаген крысиного хвоста	Рош	11 179 179 001
10-кратный PBS	Национальная диагностика	КЛ-253
Na2SO4	Научный центр Фишера	С373-500
К2СО4	Научный центр Фишера	П304-500
ХЕПЕС	Научный центр Фишера	БП410-500
D-глюкоза	Научный центр Фишера	Д16-500
MgCl2	Научный центр Фишера	БП214-500
НаОХ	Научный центр Фишера	СС255-1
Фермент протеаза	сигма	П4032
ФБС	Gibco	No 26140
Пируват натрия	Gibco	11360-070 (Английский)
L-глютамин	Gibco	25030081
Пенициллин/стрептомицин 100x (/с)	Gibco	15140122
MEM Соли Эрла	Gibco	11090
Доплата B27	Gibco	17504-044
Нейробазальный	Gibco	No 21103-049
Арабинозилцитозин (Ara-C)	сигма	Тел.: 147-94-4
Медиа Opti-MEM	Gibco	31985-070 (Английский)