Методическая статья

Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в олигодендроциты

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Assetta, B., et al. Генерация нейронов человека и олигодендроцитов из плюрипотентных стволовых клеток для моделирования нейрон-олигодендроцитарных взаимодействий. J. Vis. Exp (2020).

Это видео демонстрирует процесс создания клеток-предшественников олигодендроцитов (OPC) из эмбриональных стволовых клеток человека с последующим созреванием OPC до олигодендроцитов. Этот процесс генерации олигодендроцитов открывает множество возможностей для улучшения исследований и лечения нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Индукция клеток-предшественников олигодендроцитов человека (OPC) из плюрипотентных стволовых клеток и созревание олигодендроцитов

  1. Генерация нейронных клеток-предшественников (NPC): монослойный протокол (~7 дней). Блок-схема приведена на рисунке 1А.
    1. Используйте коммерчески доступные H1 человеческие ES-клетки на прохождении 52 (см. Таблицу материалов). Культивируйте клетки на 6-луночных планшетах, покрытых внеклеточным матриксным раствором (~0,5 мг матриксного раствора на 6-луночный планшет; см. Таблицу материалов) с использованием среды для поддержания ES-клеток (см. Таблицу материалов) и инкубируйте планшеты при 37 °C с 5%CO2.
    2. Трансдифференцируйте клетки в нейронные клетки-предшественники (NPC) с помощью установленного подхода, называемого dual SMADi, с низкомолекулярными ингибиторами для нескольких сигнальных путей. В этом случае мы используем широко распространенный коммерческий комплект и следуем протоколу монослоя, предоставленному производителем (см. Таблицу материалов).
    3. В день -1 планшет 0,5–1 x 10по 6 клеток в 6-луночный планшет, покрытый раствором с уменьшенным фактором роста (см. Таблицу материалов; ~0,5 мг матриксного раствора на 6-луночный планшет) средой для поддержания клеток эмбриональных стволовых (ES) клеток (см. Таблицу материалов). Этот матричный раствор с пониженным фактором роста используется для покрытия всех пластин, которые будут использоваться на следующих этапах.
    4. В день 0 обрабатывайте клетки в течение 24 ч средой для поддержания ЭС клеток (см. Таблицу материалов) с добавлением 2% диметилсульфоксида (ДМСО).
    5. На 1–6-й день смените полную среду на теплую (37 °C) среду для нейронной индукции, содержащую ингибиторы SMAD из коммерческого набора (см. Таблицу материалов). Если клетки делятся и достигают слияния до 7-го дня, пропустите их до плотности посева 0,5–1 x 106, как описано ранее в шаге 1.1.3.
    6. На 7-й день пропустите NPC с помощью раствора для отрыва клеток (см. Таблицу материалов) и планшет с плотностью затравки 1–2 x 105 клеток/лунку 24-луночного планшета.
    7. Эффективность дифференцировки анализа с помощью иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания на предмет отсутствия маркеров плюрипотентности, таких как OCT4, и наличия маркеров NPC, таких как PAX6, Nestin и Sox1.
    8. На этом этапе отделившиеся NPC могут быть заморожены в специализированных коммерческих носителях для заморозки NPC (см. Таблицу материалов) и храниться в жидком азоте до 3 месяцев. После однократного замораживания и оттаивания NPC все еще сохраняют мультипотенцию, позволяющую производить нейроны, астроциты и OPC с надежными протоколами.
  2. Генерация клеток-предшественников олигодендроцитов (OPC) (~7 дней). Блок-схема приведена на рисунке 1А.
    1. На 7-й день пропустите NPC с помощью раствора для отслойки клеток (см. Таблицу материалов) и поместите их с плотностью посева 1–2 x 105 клеток на лунку в 24-луночный планшет в теплой (37 °C) среде для нейронной индукции плюс ингибиторы SMAD из коммерческого набора (см. Таблицу материалов).
    2. На 8-й день приготовьте раствор 1% ДМСО в среде для дифференцировки OPC и обрабатывайте покрытых NPC в течение 24 ч. Среда для дифференцировки OPC состоит из: базальной (DMEM/F12) среды, 1% добавки N2, 1% добавки B27, основного фактора роста фибробластов (bFGF) в концентрации 20 нг/мл, разглаженного агониста (SAG) в дозе 1 мкМ, тромбоцитарного фактора роста (PDGF-AA) в концентрации 10 нг/мл (см. Таблицу материалов).
    3. На 9-й день замените среду на свежую среду для дифференцировки OPC без ДМСО. Кормите клетки через день до 15 дня. Если клетки достигают слияния до 15-го дня, пропустите их до плотности затравки 1–2 х 105 клеток на лунку, как описано в шаге 1.2.1.
    4. На 14-е сутки OPC в планшетах помещают в среду для дифференцировки OPC с плотностью 1–2 x 105 клеток/лунку в 24-луночном планшете.
    5. На этом этапе (15-й день) тестируют клетки на наличие OPC-специфичных маркеров методом иммуногистохимического окрашивания (ИГХ) или количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) (например, O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Рисунок 1В) и за отсутствие NPC-маркеров (Pax6 или Nestin; Рисунок 1D). Обычно мы обнаруживаем иммунореактивность O4 более чем в 95% клеток на 15-й день. Особое значение для болезни Альцгеймера имеет экспрессия APP (белка-предшественника амилоида), BACE1 (процессинговой протеазы β-секретазы 1) и пептида амилоид-β (Aβ) в изобилии содержится в OPC (рис. 1F).
  3. Созревание олигодендроцитов (ОЛ) (~7–20 дней)
    1. На 15-й день замените среды для созревания ОЛ: нейробазал-А, 2% добавку B27, 1 мкМ циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), 200 нг/мл Т3 трийодтиронина и клемастин 1 мкМ (см. Таблицу материалов). Меняйте носитель через день или каждый день, если это необходимо.
    2. Когда клетки достигнут 90% слияния, разделите их в соотношении 1:3 до 2 пассажей или до тех пор, пока деление клеток существенно не замедлится. Если OPC делятся слишком быстро и достигают слияния менее чем за 3 дня, добавьте Ara-C (см. Таблицу материалов) в концентрации 2–5 мкМ в течение 1–3 дней. Активная пролиферация указывает на снижение эффективности созревания.
    3. Изучайте эффективность созревания олигодендроглии путем оценки экспрессии маркеров ОЛ, например, CLDN11, PLP1, MBP с помощью количественной ПЦР, окрашивания ИГХ или иммуноблоттинга. Характерная морфология очень сложных структур (рисунок 1C) и экспрессия маркеров OL (рисунок 1E) должны быть легко обнаружены к 28-му дню.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Генерация iOPC (индуцированная клетка-предшественник олигодендроцитов) и созревание iOL (индуцированного олигодендроцита). (А) Блок-схема генерации iOPC и iOL. (B) Репрезентативные изображения яркого поля и иммунофлуоресцентные изображения iOPC на 15-й день. Olig2 (маркер пан-олигодендроглии) показан зеленым цветом, O4 (маркер OPC) — красным, а DAPI — сини...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АккутазаТехнологии стволовых клеток7920
Доплата B27ТермоФишер17504044
bFGFТермоФишерPHG 0266
лагерьМиллипорСигмаА9501
КлемастинМиллипорСигмаSML0445
Средний DMEM/F12Технологии стволовых клетокNo 36254
ДмсоТермоФишерД12345
Фетальная бычья сывороткаScienCell10
H1 человеческие ES-клеткиWiCellВА01
МатригельКорнинг354234
mTeSR плюсТехнологии стволовых клетокNo 5825
Доплата N2ТермоФишер17502001
Нейробазальная среда АТермоФишер10888-022
Заменимые аминокислотыТермоФишер11140-050
ПДГФ-ААСистемы НИОКР221-АА-010
pMDLg/pRREАддженNo 12251
ПолибренМиллипорСигмаТР-1003-Г
пРСВ-РЭВАддженNo 12253
Ингибитор горных пород Y-27632Технологии стволовых клеток72302
прогибТокрис4366
STEMdiff Neural Progenitor для замораживания средТехнологии стволовых клетокNo 5838
Набор для нейронной индукции STEMdiff SMADiТехнологии стволовых клеток8581
Т3 трийодтиронинМиллипорСигмаТ6397
Tempo-iOlogo: OPCs, полученные из иПСК человекаТемпо БиоНаукаАртикул102
TetO-Ng2-PuroАддженNo 52047
ВСВ-ГАддженNo 12259

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SMADDMSOOPCOLAra C

Похожие статьи