$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Индукция нейронов человека из плюрипотентных стволовых клеток человека
- Препарат лентивируса (~5 дней)
- Пластина ~1 миллион клеток человеческого эмбриона почки 293T (HEK293T) в каждой колбе T75, чтобы они имели ~40% сливающихся при выполнении трансфекции. Трансфектируйте их плазмидами, экспрессирующими тетрациклин-индуцируемый нейрогенин 2 (Ngn2) и пуромицин-резистентный ген (PuroR; под тем же контролем промотора оператора Tet (TetO), обратный трансактиватор тетрациклина (rtTA) и три хелперные плазмиды pRSV-REV, pMDLg/pRRE и VSV-G (12 г лентивирусной векторной ДНК и 6 мкг каждой из хелперных плазмидных ДНК). Подготовьте не менее трех колб на один препарат лентивируса. Используйте полиэтиленимин (ПЭИ) для трансфекции, следуя инструкциям производителя. Смените носитель через 16 часов и выбросьте.
- Собирайте высвободившиеся вирусные частицы путем сбора питательных сред каждый день и заменяйте свежими средами на 3 дня. Объедините собранные среды, содержащие вирусные частицы, для очистки. Отфильтруйте вирус через фильтр 0,22 мкм и центрифугируйте при 49 000 x g в течение 90 минут. Ресуспендируйте гранулу в соответствующем объеме фосфатно-солевого буфера (PBS)-глюкозы (~150 μл).
- Индукция нейронов (~5 дней)
заметка: Этот протокол индукции (рисунок 1A; блок-схема) очень эффективен как для индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS), так и для эмбриональных стволовых (ES) клеток валидированной плюрипотентности (которые могут быть проанализированы с помощью иммуногистохимического окрашивания хорошо охарактеризованных маркеров плюрипотентности; Рисунок 1B).
- Используйте коммерчески доступные H1 человеческие ES-клетки на прохождении 52 (см. Таблицу материалов). Культивируйте клетки на 6-луночных планшетах, покрытых внеклеточным матриксным раствором (~0,5 мг матриксного раствора на 6-луночный планшет; см. Таблицу материалов) с использованием среды для поддержания ES-клеток (см. Таблицу материалов) и инкубируйте планшеты при 37 °C с 5%CO2.
- На 2-й день отделите клетки ЭС (80% конфлюента) с 1 мл раствора для отделения клеток (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 мин. Переложите клетки в пробирку; промойте лунку 2 мл среды и соедините в той же пробирке. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут, повторно суспендируйте гранулу в среде и поместите ячейки на 6-луночные планшеты с матричным покрытием с плотностью посева 1 x 105 ячеек на лунку.
- В день -1 добавьте лентивирусы, экспрессирующие Ngn2 плюс PuroR и rtTA, вместе с полибреном (8 мкг/мл) к ES-клеткам в свежей среде для поддержания ES-клеток (см. Таблицу материалов). Точное количество вирусов должно определяться фактическими титрами или титрованием. Обычно мы добавляем по 5 мкл каждого вируса на лунку в 6-луночном планшете.
- В день 0 добавьте доксициклин (2 г/мл для активации экспрессии Ngn2) в модифицированную среду Dulbecco Eagle medium/nutrient mix F-12 (DMEM-F12) с добавкой N2 без морфогенов.
- В 1-й день добавьте пуромицин в свежую среду DMEM-F12 плюс N2 и доксициклин до конечной концентрации 1 мкг/мл среды. Отбирайте трансдуцированные клетки в пуромицине в течение не менее 24 ч. Более высокая концентрация пуромицина (до 5 г/мл) и более длительный период отбора (до 48 ч) могут потребоваться для адекватного удаления недостаточно трансдуцированных клеток, если титр вируса низкий.
- На 2-й день отделите дифференцирующие нейроны раствором для отслойки клеток (см. Таблицу материалов) и повторно поместите их на 24-луночные планшеты (от 80 000 до 200 000 клеток/лунку), покрытые матричным раствором (см. Таблицу материалов), и поддерживайте их в среде нейробазала-А (NBA)/B27 без доксициклина. Плотность посева имеет решающее значение.
- На этом этапе оторванные нейроны могут быть заморожены в специализированной коммерческой замораживающей среде (см. Таблицу материалов) и храниться в жидком азоте до 3 месяцев. Чистые нейроны могут быть покрыты с учетом типичной гибели ~15–20% клеток после оттаивания, культивированы отдельно или совместно с другими типами клеток мозга (см. шаг 3.2.3. для совместного культивирования с OPC).
- Культивируйте чистые iN на планшетах, покрытых растворами на основе внеклеточного матрикса в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Характерная пирамидальная морфология должна стать очевидной к 4-му дню (и 6-му дню; Рисунок 1С). Образование синапсов может быть обнаружено уже на 14-16 день и заметно на 24 день при иммуногистохимическом окрашивании стандартными пре- и постсинаптическими маркерами. (Рисунок 1D; помечен пресинаптическим маркером Synapsin 1 и дендритным маркером Map2).
2. Индукция клеток-предшественников олигодендроцитов человека (OPC) из плюрипотентных стволовых клеток и созревание олигодендроцитов
- Генерация нейронных клеток-предшественников (NPC): монослойный протокол (~7 дней). Блок-схема приведена на рисунке 2A.
- Культивировать H1 человеческие ES-клетки, как описано ранее (см. шаг 1.2.1), и трансдифференцировать их в нейральные клетки-предшественники (NPC) с помощью установленного подхода, называемого двойным SMADi, с низкомолекулярными ингибиторами для нескольких сигнальных путей. В этом случае мы используем широко распространенный коммерческий комплект и следуем протоколу монослоя, предоставленному производителем (см. Таблицу материалов).
- В день -1 наносите 0,5–1 x 106 клеток на лунку в 6-луночный планшет, покрытый раствором матрицы с уменьшенным фактором роста (см. Таблицу материалов; ~0,5 мг матричного раствора на 6-луночный планшет) средой для поддержания ES-клеток (см. Таблицу материалов). Этот матричный раствор с пониженным фактором роста используется для покрытия всех пластин, которые будут использоваться на следующих этапах.
- В день 0 обрабатывайте клетки в течение 24 ч средой для поддержания ЭС-клеток (см. Таблицу материалов) с добавлением 2% ДМСО.
- На 1–6-й день смените полную среду на теплую (37 °C) нейроиндукционную среду, содержащую ингибиторы SMAD из коммерческого набора (см. Таблицу материалов). Если клетки делятся и достигают слияния до 7-го дня, пропустите их до плотности посева 0,5–1 x 106, как описано ранее в шаге 2.1.2.
- На 7-й день пропустите NPC с помощью раствора для отрыва клеток (см. Таблицу материалов) и планшет с плотностью затравки 1–2 x 105 клеток/лунку 24-луночного планшета.
- Анализ эффективности дифференцировки с помощью иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания на предмет отсутствия, например, маркера плюрипотентности, октамер-связывающего фактора транскрипции 4 (OCT4), а также наличия NPC-маркеров, таких как парный бокс 6 (PAX6), Нестин и определяющий пол регион Y-бокс транскрипционного фактора 1 (Sox1).
- На этом этапе отделившиеся NPC могут быть заморожены в специализированных коммерческих носителях для заморозки NPC (см. Таблицу материалов) и храниться в жидком азоте до 3 месяцев. После однократного замораживания и оттаивания NPC все еще сохраняют мультипотенцию, позволяющую производить нейроны, астроциты и OPC с надежными протоколами.
- Генерация клеток-предшественников олигодендроцитов (OPC) (~7 дней). Блок-схема приведена на рисунке 2A.
- На 7-й день пропустите NPC с помощью раствора для отслойки клеток (см. Таблицу материалов) и поместите их с плотностью посева 1–2 x 105 клеток на лунку в 24-луночный планшет в теплой (37 °C) среде для нейронной индукции плюс ингибиторы SMAD из коммерческого набора (см. Таблицу материалов).
- На 8-й день приготовьте раствор 1% диметилсульфоксида (ДМСО) в среде для дифференцировки OPC и обрабатывайте покрытых NPC в течение 24 ч. Среда для дифференцировки OPC состоит из: среды DMEM/F12, 1% добавки N2, 1% добавки B27, основного фактора роста фибробластов (bFGF) в концентрации 20 нг/мл, разглаженного агониста (SAG) в концентрации 1 мкМ, тромбоцитарного фактора роста-AA (PDGF-AA) в концентрации 10 нг/мл (см. таблицу материалов).
- На 9-й день замените среду на свежую среду для дифференцировки OPC без ДМСО. Кормите клетки через день до 15 дня. Если клетки достигают слияния до 15-го дня, пропустите их до плотности посева 1–2 x 105 клеток на каждую из них, как описано в шаге 2.2.1.
- На 14-е сутки OPC в планшетах помещают в среду для дифференцировки OPC с плотностью 1–2 x 105 клеток/лунку в 24-луночном планшете.
- На этом этапе (15-й день) тестируют клетки на наличие OPC-специфичных маркеров методом окрашивания ИГХ или количественной ПЦР (например, O4, фактор транскрипции линии олигодендроцитов [Olig]-1/2, хондроитин сульфат, протеогликан 4/нейрон-глиальный антиген 2 [CSPG4/Ng2[, NK2 Homeobox 2 [NKX2.2], тромбоцитарный рецептор фактора роста альфа [PDGFRa]; Рисунок 2В) и за отсутствие NPC-маркеров (Pax6 или Nestin; Рисунок 2D). Обычно мы обнаруживаем иммунореактивность O4 более чем в 95% клеток на 15-й день. Особое значение для болезни Альцгеймера имеет экспрессия APP (белка-предшественника амилоида), BACE1 (процессинговой протеазы β-секреатазы 1) и пептида амилоида-β (Aβ) в изобилии присутствует в OPC (рис. 2F).
3. Совместное культивирование индуцированных нейронов человека (iN) и клеток-предшественников олигодендроцитов (iOPC)
- Нанесение покрытия iOPC (~3 дня)
- Планшет iOPC на 14-й день с плотностью 1 x 105 клеток на лунку в 24-луночном планшете (как описано выше на шаге 2.2.4.) в среде для дифференцировки OPC (как описано на шаге 2.2.2).
- Создание кокультуры iN-iOPC
- На 15-й день индуцированные человеческие нейроны отсоединяют на этапе 2-го дня после выбора пуромицина (как описано в шаге 1.2.6.) с помощью раствора для отслойки клеток (см. Таблицу материалов).
- Добавить нейроны к культивируемым OPC, посаживая при плотности посева 2 x 105 клеток на лунку в 24-луночный планшет с растущими OPC (с шага 3.1.1). Используйте среду для совместного культивирования, содержащую среду Neurobasal-A, 2% добавку B27 и трийодтиронин T3 в концентрации 100 нг/мл. Меняйте среду на следующий день, а затем через день. Если OPC пролиферируют слишком быстро и достигают слияния менее чем за 3 дня, добавьте цитозин арабинозид (Ara-C) в концентрации 2–5 мкМ. Репрезентативное изображение iN и iOPC, выращенных в ко-культуре после 7 дней развития нейронов, показано на рисунке 3A.
- Используйте замороженные нейроны, приготовленные описанным выше на шаге 1.2.7, для совместного культивирования с OPC. Пластинчатые нейроны замораживания и размораживания с более высокой плотностью 3 x 10 5 клеток на лунку.
- После 14–16-го дня в сокультурах формирование синапсов у иН можно наблюдать путем окрашивания ИГХ пре- и постсинаптических маркеров, а к 21-му дню синаптические точки должны быть в избытке (рисунок 3В), и нейронная активность может быть надежно зарегистрирована.
- Начиная с 21-го дня, тестируйте клетки на маркеры, специфичные для ОЛ (например, основной белок миелина [MBP] и протеолипидный белок 1 [PLP1]). К 28-му дню мы обычно наблюдаем явление оболочивания аксонов iN процессами iOL, помеченными окрашиванием IHC для специфических маркеров (рисунок 3B; нейрофиламент [NF] для аксонов iN и MBP для процессов iOPC).
