1. Подготовка к эксперименту
- Подготовьте плиты с покрытием из матрицы базальной мембраны (BMM).
заметка: BMM быстрее затвердевает при более высоких температурах. Тарелки должны быть быстро подготовлены и немедленно помещены на хранение при температуре 4 °C.
- Разморозьте BMM (см. Таблицу материалов) на льду при температуре 4 °C в течение не менее 2 часов или в течение ночи.
- Смешайте модифицированную среду Dulbecco Eagle Medium (DMEM)/F12 и BMM до конечной концентрации 80 мкг/мл. Распределите раствор BMM в чашках для культуры тканей (1 мл для 35 мм и 2 мл для чашек 60 мм) и инкубируйте при 37 °C в течение не менее 1 ч или в течение ночи перед нанесением покрытия на клетки><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неиспользованная посуда может храниться при температуре 4 °C в течение 2 недель.
- Приготовьте пластины с покрытием из поли-L-орнитина/ламинина (PLO/ламинина).
- Приготовьте 20 мкг/мл PLO (см. Таблицу материалов) в стерильном фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS+/+) и добавьте по 1 мл в каждую лунку 6-луночного планшета. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C в инкубаторе.
- На следующий день отасуньте PLO с помощью вакуумного аспиратора и дважды промойте DPBS+/+. Сушка на воздухе в капоте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные на воздухе пластины можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель, завернутыми в алюминиевую фольгу, для использования в будущем.
- Приготовьте 10 мкг/мл ламинина (см. Таблицу материалов) в DPBS+/+ и добавьте по 1 мл в каждую лунку 6-луночного планшета. Инкубировать в инкубаторе не менее 3 ч или в течение ночи при температуре 37 °C.
- Отсадите ламинин с помощью вакуумного аспиратора и добавьте 1 мл среднего или стерильного DPBS+/+.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ламининовое покрытие не должно пересыхать. Чтобы предотвратить это, следует немедленно добавить PBS или соответствующую питательную среду. Пластины с покрытием можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
- Приготовьте раствор для прохода ПСК.
- Растворите 11,49 г хлорида калия (KCl) и 0,147 г дигидрата цитрата натрия (HOC(COONa) (CH2COONa)2*2H2O) в 400 мл стерильной воды для клеточных культур (см. Таблицу материалов).
- Измерьте объем раствора и запишите его как начальный объем (Vi).
- Измерьте осмолярность и отрегулируйте ее до 570 мОсм, добавив стерильную воду для клеточных культур по формуле Vi × Oi = Vf × 570 мОсм.
- Процедить-стерилизовать раствор фильтром 0,20 мкм и внести 10 мл аликвот. Храните аликвоты при комнатной температуре (RT) до 6 месяцев.
- Получить среду для плюрипотентных стволовых клеток (ПСК)
ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК поддерживают в среде, содержащей термостабильный фактор роста фибробластов 2 (FGF2) (см. Таблицу материалов), обеспечивая график кормления без выходных. Другие коммерчески доступные носители PSC не были опробованы для использования этого протокола.
- Разморозьте среднюю добавку PSC на ночь при температуре 4 °C.
- Добавьте 10 мл добавки среды ПСК к 500 мл базальной среды ПСХ. Приготовьте 25 мл аликвот и храните при температуре −20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные аликвоты можно хранить при температуре −20 °C в течение 6 месяцев. Размороженные аликвоты необходимо хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 2 недель. Клетки могут быть заморожены для длительного хранения в среде PSC с 10% (v/v) диметилсульфоксида (ДМСО).
- Приготовьте среду для размораживания ПСК.
- Дополните среду PSC 50 нМ хроманом, 1,5 мкМ эмриказаном, 1x полиаминовой добавкой и 0,7 мкМ транс-ISRIB (коктейль CEPT) (см. Таблицу материалов).
- Отфильтровать-стерилизовать с помощью фильтра 0,20 мкм и хранить при температуре 4 °C до 4 недель.
- Подготовьте вытягиваемые стеклянные пипетки.
- Растяните стеклянные пипетки Пастера диаметром 22,9 см (9 дюймов) на две части над горелкой Бунзена, на ~2 см ниже горлышка, создав две пипетки, причем более тонкая сторона будет на ~4 см короче другой.
- С помощью пламени загните кончики натянутой стороны, чтобы получилась ровная буква «р».
- Поместите вынутые пипетки в автоклавные рукава и автоклав для стерилизации.
- Приготовьте среду для дифференцировки мозжечка (CDM).
- Смешайте модифицированную среду Dulbecco's Medium (IMDM) от Iscove и смесь питательных веществ F12 от Ham в соотношении 1:1. Дополните смесь 1x добавкой L-аланин-L-глютамина, 1% (v/v) химически определенного липидного концентрата, 0,45 мМ 1-тио-глицерина, 15 μL/мл апотрансферрина, 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 7 μг/мл инсулина (см. Таблицу материалов).
- Отфильтровать-стерилизовать с помощью фильтра 0,20 мкм, хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 1 месяца.
- Готовят среду для созревания мозжечка (ШМ).
- Дополните нейробазальную среду 1x добавкой L-аланина-L-глутамина и 1x N-2 добавкой (см. Таблицу материалов).
- Отфильтровать-стерилизовать с помощью фильтра 0,20 мкм, хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 2 недель.
2. Культура iPSC без фидера
- Разморозьте ячейки, выполнив следующие действия.
- Поместите планшет BMM (шаг 1.1) в инкубатор при температуре 37 °C для гелеобразования в течение не менее 1 часа или на ночь перед размораживанием клеток.
- Предварительно подогрейте 10 мл среды для размораживания PSC (шаг 1,5) при 37 °C.
- Перенесите криовиал с клетками из жидкого азота на водяную баню при температуре 37 °C.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание образования источника загрязнения в пространстве для культивирования клеток не рекомендуется использовать стандартную водяную баню. Вместо этого пресную воду можно нагреть в небольшом стакане до 37 °C для создания одноразовой водяной бани.
- Когда в трубке останется небольшой кусочек льда, снимите его с водяной бани, высушите трубку и опрыскайте 70% этанолом. Перенесите пробирку в колпак и с помощью серологической пипетки объемом 2 мл или 5 мл (см. Таблицу материалов) аккуратно перенесите клетки в коническую трубку объемом 15 мл.
- Добавьте 8 мл размораживающей среды ПСК в клетки по каплям, вращая коническую трубку. Центрифугируйте при 200 x g в течение 5 мин при RT.
- Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора, не нарушая клеточную гранулу. Ресуспендируйте клетки в 2 мл среды для размораживания ПСХ.
- Отберите BMM из пластины и добавьте ресуспендированные элементы по каплям по всей пластине для равномерного распределения.
- Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C, 5%CO2. На следующий день обновите носитель с помощью средства PSC. После этого ежедневно меняйте среду.
- Поддерживайте клетки в рабочем состоянии, следуя приведенным ниже инструкциям.
- Предварительно подогрейте необходимый объем среды PSC до 37 °C (например, 1 мл среды на пластину 35 мм).
- Исследуйте планшеты на наличие дифференцированных клеток или колоний и удалите дифференцированные клетки с помощью стеклянной пипетки (шаг 1.6).
Примечание: колонии iPSC имеют гладкие края с морфологически идентичными клетками.
- Меняйте отработанную среду ежедневно и проходите каждые 3-4 дня или при достижении 70% конфлюенции.
- Проход по клеткам.
- Поместите необходимое количество планшетов BMM в инкубатор не менее чем на 1 час или на ночь перед выпасом. Предварительно подогрейте необходимое количество среды PSC (шаг 1,3) при 37 °С.
- С помощью стеклянной пипетки очистите все дифференцированные клетки или колонии.
- Отсадите отработанную среду с помощью вакуумного аспиратора и добавьте среду для диссоциации ПСК, 1 мл на чашку диаметром 35 мм. Инкубировать при 37 °C в течение 1-3 мин.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Если перед добавлением среды для ПСК пчелосемьи удаляются в растворе для пропускания ПСК, время инкубации может быть сокращено.
- Отсадите раствор для пропускания PSC и добавьте предварительно подогретую среду PSC.
- С помощью стерильного наконечника для пипетки объемом 200 мкл начертите линии, параллельные друг другу в одном направлении, поверните пластину на 90° и сделайте второй набор линий царапин перпендикулярно предыдущим (сделав перекрестный заштрихованный узор поперек пластины).
- Отсасывайте раствор BMM из установленных пластин. Соберите колонии с помощью серологической пипетки и распределите их по новым BMM-планшетам.
- Инкубировать при 37 °C, 5%CO2. Меняйте среду ежедневно.
- Заморозьте ячейки.
- Подготовьте криовиалы с маркировкой содержимого и стерилизуйте под ультрафиолетовым (УФ) светом в вытяжке (см. Таблицу материалов) в течение 30 минут.
- Приготовьте замораживающую среду PSC, добавив в среду PSC 10% (v/v) ДМСО. Выполните шаги 2.3.2-2.3.5.
- Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью серологической пипетки объемом 5 мл и центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут при RT.
- Осторожно отсадите среду и повторно суспендируйте клеточную гранулу в замораживающей среде PSC.
- Распределите по криовиалкам. Поместите флаконы в контейнер для заморозки и поместите контейнер в морозильную камеру при температуре −80 °C.
- На следующий день перенесите криовиалы в жидкий азот для длительного хранения.
3. Дифференцировка мозжечка
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом дифференциации, iPSCs пропускаются на шесть 35-мм тарелок и готовы к дифференциации, когда они достигают 70% конфлюенции. Каждая 35-миллиметровая пластина будет перенесена в одну лунку из 6-луночной пластины.
- В день 0 поднимите здоровые колонии iPSC для образования EB.
- Добавьте 1 мл CDM (шаг 1.7) с добавлением 10 μM Y-27632 и 10 μM SB431542 (см. Таблицу материалов) в каждую лунку 6-луночного планшета со сверхнизким прикреплением (ULA) и поместите в инкубатор до тех пор, пока поднятые колонии не будут готовы к добавлению в лунки.
- Очистите дифференцированные клетки с помощью вытянутой стеклянной пипетки. Отсадите среду и добавьте 1 мл раствора для пропускания PSC на каждую чашку диаметром 35 мм. Инкубировать в течение 3 мин при 37 °C, отсадить и добавить 2 мл CDM с добавлением 10 мкМ Y-27632 и 10 мкМ SB431542,<бр/>
заметка: Если перед добавлением CDM колонии отрастают в растворе для пассирования PSC, время инкубации может быть сокращено.
- Под инвертированным микроскопом с проходящим светом осторожно приподнимите колонии, используя изогнутый край стеклянной пипетки с 4-кратным увеличением. После того, как каждая колония будет поднята, аккуратно перенесите все в одну лунку 6-луночного планшета ULA с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Повторите этот процесс для каждой пластины iPSC. Инкубируйте клетки при 37 °C с 5% CO2,
заметка: Если колонии слишком велики или слиты, их можно разрезать кончиком вытянутой стеклянной пипетки, чтобы создать меньшие БЭ.
- На 2-й день добавьте FGF2 в каждую лунку до конечной концентрации 50 нг/мл.<бр/>
заметка: FGF2, используемый для дифференцировки мозжечка, не является термостабильным. Этот протокол не тестировался с термостабильным FGF2.
- На 7 день сделайте среднюю смену на 1/3. Для 3 мл общей среды в лунке с помощью пипеттора объемом 1 000 мкл осторожно отсасывайте 1 мл отработанной среды и замените его 1 мл свежей CDM. Инкубируйте БЭ в течение 7 дней.
- На 14-й день осторожно отасуньте почти всю отработанную среду с помощью пипеттора объемом 1000 мкл. Чтобы обеспечить минимальное повреждение EB, поверните пластину, чтобы собрать все EB в центре пластины, а затем наклоните пластину и медленно отсасывайте от края.
- По мере уменьшения количества медиума медленно положите пластину на ровную поверхность и продолжайте аспирацию. Оставьте достаточно среды, чтобы избежать высыхания EB. После этого добавьте 3 мл свежего CDM с добавлением 10 μM Y-27632. Перенесите БЭ с помощью серологической пипетки объемом 10 мл в чашку, покрытую PLO/ламинином (шаг 1.2).
заметка: В зависимости от последующего применения, ЭБ могут быть перенесены на 6-луночную пластину PLO/ламинина или отдельные ЭБ могут быть перемещены в одну лунку 24-луночной пластины с покрытием PLO/ламинином или покровным стеклом.
- На 15-й день аспирируйте среду и замените ее свежей CDM.
заметка: Важно добавлять в лунки достаточное количество среды, чтобы обеспечить достаточное количество среды между кормлениями, так как со временем произойдет испарение (например, для лунки в 6-луночном планшете добавьте 3 мл среды). Если среда начала закислять (стала прозрачной и желтой), обновите среду, даже если ее нет в графике кормления до конца протокола.
- На 21 день отсадите отработанную среду и замените ее КИМ. На 28 день смените среду на свежую КИМ. На 35 день соберите клетки для дальнейшего применения.
