1. Дифференцировка HiPSC в смешанные нейроны и глии
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура занимает около 28 дней, основные шаги описаны на рисунке 1.
- Генерация эмбриоидных тел (Дни 0 → 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура требует хороших навыков ручного труда и точности. Фрагменты колонии HiPSC (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека) должны быть одинакового размера для получения однородных эмбриоидных телец (БЭ) на следующих этапах. Морфологически дифференцированные колонии (с крупными цитоплазматическими фракциями и мелкими ядрышками) следует отбраковать.
- Обновите среду hiPSC (чашка Петри объемом 3 мл/60 мм) перед разрезанием недифференцированных колоний HiPSC (около 1 мм в диаметре, см. рисунок 2A) в стерильных условиях.
- Разрежьте недифференцированные колонии (как показано на рисунках 2А и 2В) на фрагменты размером примерно 200 мкм х 200 мкм с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 30G. Используйте стереоскопический микроскоп с 4-кратным увеличением в ламинарном шкафу при комнатной температуре.
- Отделите фрагменты колонии от поверхности чашки с помощью пипетки объемом 200 мкл, осторожно накачав под нее пипетирующую среду, чтобы приподнять кусочки.
- Перенесите все отделенные фрагменты и среду в пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 1, 2 или 5 мл.
- Промойте чашку 2 мл полной среды ИПСК для восстановления всех фрагментов.
- Центрифугируйте при 112 х г в течение 1 мин.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте фрагменты в 5 мл полной среды hiPSC EB (см. Таблицу материалов).
- Поместите фрагменты колонии в чашку Петри со сверхнизкой насадкой 60 мм (чашка Петри 5 мл/60 мм).
- Инкубируйте чашку Петри в течение ночи при 37 °C и 5%CO2.
- На следующий день (день 1) соберите БЭ и их среду в пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 1, 2 или 5 мл.
- Центрифугируйте БЭ при давлении 112 x g в течение 1 мин.
- Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте БЭ в 5 мл полной среды hiPSC EB с помощью пипетки объемом 1, 2 или 5 мл.
- Поместите EB на новую 60-миллиметровую чашку Петри со сверхнизким креплением (чашка Петри 5 мл/60 мм).
- Инкубируйте чашку Петри в течение ночи при 37 °C и 5%CO2.
- В день 1 посуду покройте матрицей базальной мембраны (например, матригелем, далее именуемым «стандартная матрица») или любым другим подходящим белковым субстратом (например, ламинином).
- Храните стандартную матрицу (см. Таблицу материалов) при температуре -80 °C в аликвотах объемом 200 мкл с помощью холодных пробирок объемом 1,5 мл и холодных пипеток объемом 5 или 10 мл.
- Разморозьте 200 мкл стандартной матрицы на льду.
- Разведите 200 мкл стандартной матрицы в 20 мл базальной (DMEM/F12) среды (разведение 1:100).
- Покройте этим раствором 60-мм чашки Петри (5 мл/чашка).
- Инкубируйте посуду с покрытием при температуре 37 °C в течение ночи.
заметка: Эти чашки будут использоваться для тарелирования БЭ (около 50 БЭ на чашку) и генерации нейроэпителиальных агрегатов (розеток); Смотрите шаг 1.3.
- Генерация нейроэпителиальных агрегатов (розеток) (дни 2 → 7)
- На 2-й день удалите стандартный раствор матричного покрытия с 60-мм чашек Петри (не нужно промывать пластины) и заполните их 5 мл/чашку полной нейроэпителиальной индукционной средой (NRI); см. Таблицу материалов.
- Перенесите плавающие EB (из шага 1.1.14) в посуду с покрытием (~50 EBs/чашку) с помощью пипетки объемом 200 мкл под стереоскопическим микроскопом при 4-кратном увеличении и поместите в ламинарный шкаф.
заметка: Очень важно выбирать однородные БЭ среднего размера (~200-300 мкм в диаметре). Слишком маленькие БЭ могут плохо выживать во время нейроэктодермальной дифференцировки, в то время как слишком большие БЭ имеют тенденцию подвергаться некрозу ядра.
- Инкубируйте посуду при 37 °C и 5% CO2.
- На следующий день (день 3) проверьте чашки под микроскопом при 10-кратном увеличении, чтобы убедиться, что все ЭБ прикреплены.
- Аккуратно выполните полную смену среды с помощью полной среды NRI.
- Меняйте среду NRI через день до 7 дня, когда должны быть видны нейроэпителиальные агрегаты (розетки).
- На 7-й день нанесите слой стандартной матрицы (или ламинина), как описано в шаге 1.2, на планшет или чашку любого требуемого формата: 96-луночные планшеты (100 мкл/лунка), 24-луночные планшеты (250 мкл/лунка), 12-луночные планшеты (500 мкл/лунка), чипы MEA (для электрической активности, 1 мл/однолуночный чип) или чашки Петри 60 мм (4 мл/чашка).
- Инкубируйте пластины/чашки с покрытием не менее 2 часов при 37 °C и 5%CO2.
- Розеточная диссоциация и дифференцировка нейронов (дни 8 → 28)
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура требует хороших навыков ручного труда и точности. Чтобы избежать сбора мезодермальных и эндодермальных клеток, следует диссоциировать и собирать только розетковидные структуры эктодермы.
- На 8-й день разрежьте розеткообразные структуры на фрагменты под стереоскопическим микроскопом при 10-кратном увеличении в стерильных условиях. Используйте шприц объемом 1 мл с иглой 30G. Обратите внимание, что розетки имеют тенденцию отделяться от блюда при легком прикосновении иглой.
- Завершите отслоение фрагментов розетки с помощью пипетки объемом 200 мкл.
- Перенесите чашку под ламинарный колпак и соберите фрагменты розетки и их среду в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 1, 2 или 5 мл. Промойте чашку 2 мл среды NRI, чтобы восстановить все фрагменты.
- Прикручивайте фрагменты розетки при 112 x g в течение 2 минут.
- Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Аккуратно ресуспендируйте гранулу в 1 мл 1x DPBS (без кальция и магния) и аккуратно пипетируйте фрагменты розетки вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1 000 мкл для их частичной диссоциации.
- Добавьте 4 мл полной среды NRI и подсчитайте клетки с помощью трипанового синего и автоматического счетчика клеток (см. Таблицу материалов)
заметка: Разведите 20 мкл клеточной суспензии в 20 мкл трипанового синего. Этот этап можно пропустить, если клетки не могут быть приведены в одноклеточную суспензию. Если фрагменты розетки не выглядят полностью диссоциированными, фрагменты розетки, полученные из примерно 50 EBs/60-мм чашки, могут быть ресуспендированы в 50 мл полной среды NRI и покрыты, как показано в таблице 1.
- Аспирируйте стандартный матричный (или ламининовый) раствор покрытия из чашек Петри, планшетов и/или микросхем MEA (из шага 1.3.7). Не давайте им высохнуть.
- Поместите клетки в полную среду NRI в соответствии с планом исследования (около 15 000 клеток/см2; показания объема покрытия см. в таблице 1).
- Инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C и 5%CO2.
- На 10-й день проведите полное изменение среды с использованием полной среды для дифференцировки нейронов (ND); см. Таблицу материалов.
- Обновляйте полную среду ND два раза в неделю до 28-го дня.
Таблица 1.
Примечание о плотности диссоциированной розетки: если фрагменты розетки не выглядят полностью диссоциированными, то для достижения плотности покрытия клеток около 15.000 клеток/см2, диссоциированные фрагменты розетки, полученные из примерно 50 EBs/1 x 60-мм чашки, могут быть ресуспендированы в 50 мл полной среды NRI и покрыты следующим образом (в зависимости от формата пластины):
| Планшеты Multiwell / MEA | Площадь роста (см2/лунка) | Объем суспензии ячеек к планшету на лунку (или чип MEA) | Максимальное количество пластин, которые могут быть покрыты (с 50 мл клеточной суспензии) |
| 96 скважин | 0,3 | 100 мкл | 5 |
| 48 скважин | 0,7 | 220 мкл | 4 |
| 24 скважины | 2 | 625 мкл | 3 |
| 12 скважин | 4 | 1,25 мл | 3 |
| 6 скважин | 10 | 3.125 мл | 2 |
| Микросхема MEA с одной скважиной | 3.5 | 1,1 мл | 45 |
