Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Диссоциация вентральных клеток среднего мозга
- Перенесите кусочки вентрального среднего мозга под ламинарный колпак. Удалите сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) и добавьте 1 мл предварительно подогретой (37 ºC) 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (трипсин-ЭДТА) в коническую трубку (объемы, достаточные для размещения до 12 частей вентрального среднего мозга). Инкубируйте ткань при температуре 37 ºC в течение 5-10 минут.
- Удалите трипсин-ЭДТА под капюшоном и добавьте в ткань 1 мл деактивирующей среды (сыворотка деактивирует трипсин).
- Удалите дезактивирующее средство и промойте салфетку в 1 мл готового средства дважды.<бр/>
заметка: Чтобы предотвратить отбрасывание диссоциированных клеток, избегайте удаления всей среды из пробирки и пипетирования ткани.
- Добавьте 1 мл готового средства и растирайте ткань с помощью стеклянной пипетки с огненной полировкой. Избегайте образования пузырьков и продолжайте растирать до тех пор, пока не будет получена суспензия с одной ячейкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для полной диссоциации требуется 8-10 проходов через узкий наконечник .
- Центрифугируйте клетки при давлении 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) и удалите среду.
- Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл готовой среды, медленно пипетируя вверх и вниз до четырех раз.
2. Покрытие вентральных клеток среднего мозга
- Смешайте 10 μл клеточной суспензии с 90 μл раствора Трипанового синего и подсчитайте количество клеток гемоцитометром.
заметка: Жизнеспособность клеток также может быть проверена на этом этапе.
- Поместите стерилизованные колпачки микроцентрифужных пробирок в чашки Петри диаметром 100 мм и перенесите покровные стекла с покрытием из поли-L-орнитина/ламинина с помощью щипцов по одной.
заметка: Не стирайте покровные стекла и избегайте высыхания ламинина, так как это может привести к неравномерному посеву культур и снижению выживаемости клеток.
- Отрегулируйте объем до 1 500 ячеек на 1 мкл, добавив всю среду и 100 мкл (всего 150 000 клеток) клеточной суспензии поверх каждого покровного стекла (объем оптимален для покрытия поверхности покровного стекла без проливания). Закройте чашки Петри и инкубируйте их в течение 1 часа в инкубаторе для культуры увлажненных тканей (37 °C, 5% CO2).
заметка: КРИТИЧЕСКИЙ ЭТАП: Этот этап необходим для улучшения прикрепления и жизнеспособности клеток, а также для увеличения количества покровных стеблей на эмбрион. В качестве альтернативы ячейки могут быть перенесены непосредственно в скважины (содержащие покровные стекла), но количество ячеек должно быть увеличено до 350 000 на скважину (вместо 150 000). Другими словами, используя этот метод, можно получить 8-10 покровных пластин, в то время как прямая передача дает около 3-4 покровных пластин из-за ячеек, которые крепятся к пластинам (рядом или под покровными пластинами). Средняя жизнеспособность культур, использующих этот метод, составила около 90%.
3. Рост и поддержание культуры
- После 1 часа инкубации осторожно переложите покровные стекла, включая среду, в 24-луночные планшеты, содержащие 400 μл предварительно подогретой (до 37 ºC) полной среды (общий объем: 500 μл). Инкубируйте клетки в течение ночи (O/N) при 37 ºC.
- В течение 24 часов после инкубации лунок аккуратно добавьте в каждую лунку 500 мкл готовой среды.
Примечание: Первые несколько часов являются наиболее критическим этапом для выживания дофаминергических нейронов, и количество выживших клеток существенно не меняется после этого момента.
- Не добавляйте дополнительные среды в культуры в течение первых двух недель или до тех пор, пока среда не станет желтой. Если культивирование длится более двух недель или цвет среды меняется на желтый, замените половину среды (500 μл) на свежую, полностью прогретую среду (обычно каждые две недели).
заметка: Дофаминергические нейроны в культурах выживали бы в этих условиях более шести недель.
