Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Получение образцов тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Критический компонент этого протокола требует надлежащего обращения с донорской тканью, начиная сразу с момента вскрытия. Общая жизнеспособность образца в значительной степени зависит от минимизации посмертного интервала (PMI), немедленного переноса ткани в соответствующую холодную среду с добавлением антибиотиков/антимикотиков, удержания образца на влажном льду во время транспортировки и поддержания стерильной техники на протяжении всего протокола.
- Получив уведомление о скором донорстве, подготовьте набор для сбора образцов. Используя транспортировочный ящик с изолированным контейнером, который можно непосредственно использовать для обратной транспортировки образца ткани, включите в него следующие материалы:
- Включите материалы для стерильной подготовки, в том числе стерильные перчатки, простыни и скальпели.
- Включите 8 - 10 стерильных конических пробирок объемом 50 мл, содержащих транспортировочную среду объемом 30 мл, в изолированный контейнер со льдом или холодные пакеты. <бр/>
заметка: В то время как любая стандартная среда для клеточных культур может работать, наилучшая жизнеспособность образца достигается при использовании Hibernate-A с добавлением антибиотика/антимикотика.
- Приложите все дополнительные пробирки для образцов для других анализов (например, фиксаторов).
- Если вскрытие не будет проводиться в месте проведения исследования, приложите документ, в котором четко указано, как собрать образец опухоли. Это включает в себя такие детали, как поддержание стерильности, хранение пробирок с образцами на влажном льду, а также образцы из среднего мозга и мозгового вещества, поскольку опухолевые клетки часто проникают в эти области.
- Сохраняйте стерильность во время вскрытия. Считайте, что мозг внутри черепа стерилен, поэтому соблюдайте технику стерильности (включая смену перчаток) после того, как череп открыт. Крайне важно избегать загрязнения кожи и волос.
- Рассекайте опухоль с вентральной стороны («живота» моста, см. рисунок 1). Стерильным скальпелем отрежьте небольшие кусочки размером 1 см от опухоли и немедленно переложите в холодные транспортные среды (см. ПРИМЕЧАНИЕ в пункте 1.1.2) и положите на влажный лед. Поместите 10 мл ткани в каждую пробирку, в результате чего окончательный объем ткани и среды в каждой пробирке составит 40 мл. <бр/>
заметка: В случае диффузной внутренней понтинной глиомы (DIPG) опухоль диффузно проникает в мост и часто в остальную часть ствола мозга. Таким образом, соберите как можно больше образца, обычно включая 3–4 пробирки (30–40 мл ткани) из моста и 1–2 пробирки (10–20 мл ткани) из среднего мозга и мозгового вещества.
- Соберите образцы из среднего мозга и мозгового мозга рядом с мостом, которые часто содержат много опухолевых клеток.
- После сбора образцов отправьте образцы на ночь (O/N) на влажном льду в изолированном контейнере. Не отправляйте образец на сухом льду, так как замораживание убьет клетки.
2. Подготовка к обработке образцов
- Перед началом подготовки образцов простерилизуйте капюшоны для культивирования тканей вместе с бритвенными лезвиями, изогнутыми гемостатами и любыми другими нестерильными инструментами под ультрафиолетовым (УФ) светом в течение 1 ч. Выполните все следующие шаги в стерильных условиях, чтобы предотвратить загрязнение культур.
- Готовят и стерильные фильтрующие растворы.
- Для приготовления 1,8 М раствора сахарозы растворить 308,07 г сахарозы в 300 мл дистиллированной воды. Добавьте 50 мл 10-кратного буферизованного физиологического раствора Ханка (HBSS) без кальция или магния и доведите общий объем до 500 мл с помощью дистиллированной воды. Хранить при температуре 4 °C.
- Для приготовления раствора ферментативного сбраживания берут по 50 мл HBSS с кальцием и магнием на каждые 10 мл измельченного фарша и добавляют 500 мкл 5 мг/мл дезоксирибонуклеазы I (конечная концентрация 50 мкг/мл), 500 мкл 2,5 мг/мл коллагеназы I/II и раствор диспаза (конечная концентрация 25 мкг/мл), и 500 мкл 1 М буфера 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES). Предварительно подогрейте раствор для варивания на водяной бане при температуре 37 °C.
- Для приготовления основы опухолевой стволовой среды (TSM) смешайте 250 мл нейробазала-A, 250 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco: смесь питательных веществ F12 (DMEM/F12), 5 мл 100x антибиотика-антимикотика, 5 мл 200 мл L-аланил-L-глутамина дипептида (GlutaMAX-A), 5 мл буфера HEPES, 5 мл 100 мМ пирувата натрия и 5 мл 100x заменимых аминокислот MEM.
- Чтобы приготовить полный TSM с факторами роста, добавьте в основу TSM следующие добавки: 50x B27 Supplement Minus Vitamin A (1:50), Эпидермальный фактор роста человека (H-EGF, 20 нг/мл), Фактор роста фибробластов человека (H-FGF, 20 нг/мл), Тромбоцитарный фактор роста человека AA (H-PDGF-AA, 10 нг/мл), Тромбоцитарный фактор роста человека BB (H-PDGF-BB, 10 нг/мл) и раствор гепарина (2 мкг/мл).
- Предварительно охладите лабораторную центрифугу, оснащенную ротором с качающимся ведром, до 4 °C.
3. Механическая диссоциация
- Переложите ткань в высокостенную чашку для клеточных культур размером 100 мм x 20 мм. Извлеките остатки среды из транспортировки и замените ее на 10–15 мл холодных питательных сред.
- Используя изогнутые гемостатики для захвата лезвия бритвы, мелко измельчите ткань, удаляя при этом явные кровеносные сосуды или мозговые оболочки.
заметка: Конечные фрагменты ткани должны быть меньше 1 мм (см. рисунок 2B).
- Переложите салфетку в чистую коническую трубку объемом 50 мл. Вымойте чашку для клеточных культур еще 5 мл холодной питательной среды и переложите в коническую пробирку. При необходимости повторите этот шаг промывки, чтобы перенести оставшуюся ткань.
- С помощью серологической пипетки объемом 10 мл осторожно растирайте (4–5 раз). Дайте более крупным фрагментам ткани осесть на дно трубки. При необходимости кратковременно центрифугируйте образец в течение 1 мин (350 x g, 4 °C).
- Соберите механически диссоциированную фракцию.
- Извлеките надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через фильтр 100 мкм в новую коническую трубку объемом 50 мл с надписью «Механическая диссоциация». Переверните фильтр над исходной конической трубкой и промойте питательной средой для восстановления фрагментов ткани.
- Центрифугируйте фракцию «Механическая диссоциация» в течение 5 минут (350 x g, 4 °C).
- Удалите надосадочную жидкость из гранулированной фракции «Механическая диссоциация» и ресуспендируйте ткань в холодных питательных средах. Если в конической трубке «Механическая диссоциация» содержится более 5 мл ткани, разделите ткань на другие конические трубки объемом 50 мл таким образом, чтобы ни в одной трубке не было более 5 мл ткани.
- Механически диссоциированную фракцию хранить на льду до этапа центрифугирования сахарозы (Шаг 5). В альтернативном варианте, механически диссоциированная фракция может переходить к Стадии 5 в течение инкубационного периода ферментативной диссоциации (Стадия 4.4).
4. Ферментативная диссоциация
- Если в трубке, содержащей оставшиеся более крупные фрагменты ткани, содержится более 5 мл ткани, разделите ткань на другие новые конические пробирки объемом 50 мл таким образом, чтобы ни в одной трубке не было более 5 мл ткани.
- Центрифугируйте коническую пробирку (пробирки), содержащую оставшиеся фрагменты ткани, в течение 5 минут (350 x g, 4 °C).
- Удалите надосадочную жидкость и добавьте предварительно подогретый ферментативный раствор для разложения таким образом, чтобы на каждый 1 мл ткани приходилось 5 мл раствора для разложения (например, 25 мл раствора для разложения на 5 мл ткани).
- Запечатайте конические крышки пробирок лабораторной пленкой и инкубируйте реакцию на вращателе при 37 °C в течение 30 минут.
- После инкубации тщательно растирайте образцы (см. рисунок 2C).
- С помощью серологической пипетки объемом 10 мл пипетируйте образец вверх и вниз 6 - 8 раз. Избегайте образования чрезмерных пузырьков воздуха.
- Добавьте наконечник пипетки объемом 1 000 мкл к концу пипетки и растирайте еще 6–8 раз.
- Дайте оставшимся кусочкам осесть на дно пробирки. Удалите и отфильтруйте надосадочную жидкость с еще взвешенными клетками через фильтр 100 мкм в новую коническую пробирку объемом 50 мл с надписью «Ферментативная диссоциация» и храните на льду.
- Если остались значительные фрагменты ткани, добавьте к фрагментам дополнительно 10 мл HBSS с кальцием и магнием и повторите шаги 3.5.1 и 3.5.2. Отфильтруйте этот конечный раствор через фильтр 100 мкм в пробирку «Ферментативная диссоциация».
- Центрифугируйте пробирку для «Ферментативной диссоциации» в течение 5 минут (350 x g, 4 °C) и продолжайте центрифугирование градиентом сахарозы.
5. Градиентное центрифугирование сахарозы
- Если образцы все еще находятся во взвешенном состоянии в растворе, центрифугируйте в течение 5 минут (350 x g, 4 °C).
- Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать ткань в 20 мл холодного HBSS без кальция и магния. Доведите общий объем до 25 мл с помощью холодного HBSS.
- Медленно добавьте 25 мл 1,8 М раствора сахарозы и переверните пробирку для перемешивания. В результате получается градиент сахарозы 0,9 М.
- Центрифуга без тормоза в течение 10 мин (800 x g, 4 °C). Использование тормоза центрифугирования нарушит градиент и снизит выход продукции (см. Рисунок 2D для примера образца до и после центрифугирования).
- Тщательно отсасывайте остатки миелина и как можно больше раствора сахарозы. Промойте образец, добавив 30 мл холодного HBSS без кальция и магния и осторожно перемешав. Центрифуга в течение 5 минут (350 x g, 4 °C).
6. Лизис эритроцитов ACK
- Удалите надосадочную жидкость для стирки. Добавьте 5 мл буфера для лизиса ACK и аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу, вращая пробирку в течение 1 минуты при RT.
- Угасите лизис, добавив 30 мл холодного HBSS без кальция и магния.
- Центрифуга в течение 5 минут (350 x g, 4 °C).
7. Начальное обслуживание культуры
- Ресуспендируйте конечные клеточные гранулы в 10 - 15 мл теплого полного TSM с факторами роста и количественно оцените плотность жизнеспособных клеток на гемоцитоматце с использованием исключения трипанового синего.
заметка: Диапазон жизнеспособных клеток широко варьируется в зависимости от обстоятельств донорской ткани, и количественная оценка может быть затруднена на этой ранней стадии из-за остаточного клеточного мусора. В идеальном случае стремитесь иметь один миллион живых клеток на образец. В случаях, когда остается чрезмерное количество мусора, наберите пластину меньшей плотности в колбе T175.
- Перенесите окончательные клеточные суспензии в новую колбу для культур T75. Повышайте дозу дополнительных факторов роста через день для поддержания общего уровня факторов роста и мониторинга развития нейросфер опухолевых клеток (см. Рисунок 2Е и Рисунок 3).
