Дифференцировка нервных клеток-предшественников спинного мозга в моторные нейроны

Аннотация

Источник: Taga, A. et al., Создание электрофизиологической платформы для моделирования БАС с помощью регионально-специфических человеческих плюрипотентных стволовых клеток астроцитов и нейронов. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует метод дифференциации нервных клеток-предшественников спинного мозга (NPC) в моторные нейроны. В нем подробно описан процесс культивирования NPC на покрытой культуральной пластине с использованием специализированных сред, обогащенных специфическими ингибиторами, направленными на облегчение дифференцировки NPC в зрелые моторные нейроны.

Протокол

1. Размораживание культур нейронных клеток-предшественников (NPC)

1. Покройте 10-сантиметровые пластины полиорнитином (PLO) и ламинином за день до размораживания клеток.
   1. Добавьте в планшеты 5 мл PLO, разведенного до 100 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS) или дистиллированной воде (dH₂O). Инкубировать при температуре 37 °C в течение минимум 1 часа до ночи.
   2. Отсадите раствор PLO и трижды промойте пластины PBS. (PLO токсичен, если его не мыть должным образом.)
   3. Добавьте ламинин, разведенный в PBS, до концентрации 10 мкг/мл в пластины, покрытые PLO. Инкубировать при температуре 37 °C в течение миним....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 см стерильные тарелки для культивирования	сокол	353003
Заменимые аминокислоты (NEAA)	Термофишер	11140050	Рабочая концентрация 100x
Добавка N - N2 Добавка	Термофишер	17502048	Рабочая концентрация 100x
L-глютамин	Термофишер	No 25030	Рабочая концентрация 100x
Нейробазальный	Термофишер	21103049	Рабочая концентрация 1x
Ретиноевая кислота (РА)	сигма	Р2625	Растворите 100 мг в 3,3 мл ДМСО, чтобы получить 100 мл стокового раствора. Залейте в запас 100 μл/тубу и заморозьте при -80 ºC. Возьмите 200 мкл 100 мМ бульона и разбавьте в 10 раз (добавьте 1,8 мл ДМСО), чтобы получить 10 мМ бульона. Аликвота 50 μл/туба и хранить при -80 ºC. Разбавить до 1:10000 для использования. (рабочая концентрация 2 мкМ).
Полиорнитин (PLO)	Сигма-Олдрич	П3655	Растворите 100 мг в 1 мл ddW, чтобы получить 100 мг/мл исходного раствора. Разложите поголовье по 100 мкл пробирок. (рабочая концентрация 100 мкг/мл)
Ламинин	Термофишер	No 23017-015	Исходный раствор 1 мг/мл, рабочая концентрация 10 мкг/мл (покрытие), 1 мкг/мл (клеточные среды)
Аскорбиновая кислота (ASAC)	сигма	А4403	Растворите 100 мг в 250 мл dH2O, чтобы получить запас 0,4 мг/мл. Стерильно отфильтровать через фильтр 0,22 мкм, аликвотировать и заморозить при -80 ºC. Разбавить до 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 0,4 мкг/мл).
Цилиарный нейротрофический фактор (CNTF)	Пепротех	450-13	Растворите 100 μг в 1 мл стерильного PBS, а затем добавьте 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS до 10 μг/мл. Аликвот и заморозьте при -80 ºC. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Соединение Е	Абкам	АБ142164	Растворите 250 мкг в 2,0387 мл ДМСО, чтобы получить запас 250 мкм. Аликвотировать и заморозить при -80 ºC. Развести 1:2000 для использования. (рабочая концентрация 125 нМ).
DMEM/F12	Термофишер	113300	Рабочая концентрация 1x
Нейротрофические глиальные клеточные линии (GDNF)	Пепротех	450-10	Растворите 100 мкг в 1 мл PBS до 100 мкг/мл, а затем добавьте 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS до 10 мкг/мл. Аликвот и заморозьте при -80 ºC. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Ингибитор ROCK-I	Пепротех	1293823	Растворите 5 мг в 1480 мкл dH2O, чтобы получить 10 мМ запаса, аликвоту и заморозьте при -80 ºC. Разбавьте при 1:500 для использования. (рабочая концентрация 20 мкМ).
Карандашлин/Стрептомицин	Термофишер	15140122	Рабочая концентрация 100x
Пурморфамин (ПМН)	Миллипор-Сигма	540223	Растворите 5 мг в 9,6 мл ДМСО, чтобы получить 1 мл раствора. Аликвоту и заморозьте при -80 ºC. Разбавьте 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 1 мкМ).
Рекомбинантный нейротрофический фактор человеческого мозга (BDNF)	Пепротех	450-02	Ненадолго центрифугируйте перед восстановлением. Растворите 100 мкг в 1 мл PBS до 100 мкг/мл, а затем добавьте 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS до 10 мкг/мл. Аликвот и заморозьте при -80 ºC. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1)	Системы НИОКР	291-Г1-200	Растворите 200 мкг в 2 мл PBS до 100 мкг/мл, затем добавьте 18 мл 0,1% BSA-PBS для получения 10 мкг/мл и храните при -80 ºC. Аликвоту и заморозьте при -80 ºC. Разбавьте 10 мкг/мл в соотношении 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Нейротрофические глиальные клеточные линии (GDNF)	Пепротех	450-10	Растворите 100 мкг в 1 мл PBS до 100 мкг/мл, а затем добавьте 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS до 10 мкг/мл. Аликвот и заморозьте при -80 ºC. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Ретиноевая кислота (РА)	сигма	Р2625	Растворите 100 мг в 3,3 мл ДМСО, чтобы получить 100 мл стокового раствора. Залейте в запас 100 μл/тубу и заморозьте при -80 ºC. Возьмите 200 мкл 100 мМ бульона и разбавьте в 10 раз (добавьте 1,8 мл ДМСО), чтобы получить 10 мМ бульона. Аликвота 50 μл/туба и хранить при -80 ºC. Разбавить до 1:10000 для использования. (рабочая концентрация 2 мкМ).
Соединение Е	Абкам	АБ142164	Растворите 250 мкг в 2,0387 мл ДМСО, чтобы получить запас 250 мкм. Аликвотировать и заморозить при -80 ºC. Развести 1:2000 для использования. (рабочая концентрация 125 нМ).
Дополнение B - B27 Дополнение	Термофишер	21985023	Рабочая концентрация 50x
Стерильные колпаки для клеточных культур	Компания «Бейкер	СГ-600
Настольная центрифуга для клеточных культур	ТермоФишер	75004261	Sorvall Legend X1R
Водяная баня	ТермоФишер	No 2332	Изотемп
Инкубатор для клеточных культур с контролируемой влажностью	ТермоФишер	370	установка на 37 ºC, 5 % CO2

»