Дифференцировка нервных клеток-предшественников спинного мозга в моторные нейроны

Аннотация

Источник: Taga, A. et al., Создание электрофизиологической платформы для моделирования БАС с помощью регионально-специфических человеческих плюрипотентных стволовых клеток астроцитов и нейронов. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует метод дифференциации нервных клеток-предшественников спинного мозга (NPC) в моторные нейроны. В нем подробно описан процесс культивирования NPC на покрытой культуральной пластине с использованием специализированных сред, обогащенных специфическими ингибиторами, направленными на облегчение дифференцировки NPC в зрелые моторные нейроны.

Протокол

1. Размораживание культур нейронных клеток-предшественников (NPC)

1. Покройте 10-сантиметровые пластины полиорнитином (PLO) и ламинином за день до размораживания клеток.
   1. Добавьте в планшеты 5 мл PLO, разведенного до 100 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS) или дистиллированной воде (dH₂O). Инкубировать при температуре 37 °C в течение минимум 1 часа до ночи.
   2. Отсадите раствор PLO и трижды промойте пластины PBS. (PLO токсичен, если его не мыть должным образом.)
   3. Добавьте ламинин, разведенный в PBS, до концентрации 10 мкг/мл в пластины, покрытые PLO. Инкубировать при температуре 37 °C в течение минимум 1 часа, желательно в течение ночи. После инкубации аспирируйте раствор ламинина без промывки для усиления адгезии клеток.
      заметка: Пластины можно заранее покрыть PLO, трижды промыть водой, высушить в стерильном колпаке и хранить при температуре 4 °C.
2. Разморозьте один флакон NPC, содержащий 6 x 10⁶ клеток/флакон для каждой 10-сантиметровой пластины для культивирования клеток.
3. Извлеките криопробирку NPC из жидкого азота и немедленно поместите ее на водяную баню при температуре 37 °C на срок до 2 мин. Быстро разморозьте, встряхивая флакон, пока не образуется небольшой кусочек льда, окруженный жидкостью.
4. Перенесите клеточные агрегаты в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 1000 мкл и добавьте до 15 мл предварительно нагретой среды для нейронной дифференцировки (NDM) или модифицированной среды Dulbecco's Eagles Medium (DMEM) / добавки Ham's F21 F12 для разбавления диметилсульфоксида (ДМСО).
5. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин.
6. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клеточную гранулу средой для дифференцировки моторных нейронов (MN) (Таблица 1) + ROCK-I (20 μM) и с помощью пипетки объемом 1000 μL растирайте вверх и вниз до получения суспензии одной клетки (до 5 раз).
7. Перенесите одиночную суспензию на 10-сантиметровую пластину с покрытием PLO-Laminin.
8. Перенесите планшет в инкубатор и оставьте его в покое на ночь, чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток

2. Дифференциация NPC спинного мозга на моторные нейроны

1. Выполните начальные этапы, как указано в шагах 1.1-1.8, с конечной средой для дифференцировки MN + ROCK-I (20 μM).
2. На следующий день после нанесения покрытия произведите полную замену среды на среду дифференцировки MN без ROCK-I, а затем меняйте среду через день. В выходные дни подкармливайте клетки в пятницу, а затем снова в понедельник. При необходимости промойте клетки PBS, чтобы удалить остатки клеток.
3. Смените среду средой для дифференцировки MN + цитозин арабинозид (ARA-C) (0,02 мкМ) и инкубируйте в течение 48 ч, когда глиальные коммитированные предшественники появляются в виде одиночных пролиферирующих плоских клеток под постмитотическими предшественниками MN, агрегированными в клеточные кластеры.
   заметка: Обычно это происходит в течение первых 7 дней после первоначального осаждения, хотя может быть вариабельность в зависимости от клеточной линии.
4. Через 48 ч аспирируйте среду, содержащую ARA-C, осторожно промойте культуры PBS три раза и замените среду на свежую среду MN без ARA-C.
5. После лечения препаратом ARA-C проводите замену среды через день (или в понедельник, среду и пятницу), удаляя старую среду с помощью ручной пипетки, а не вакуумного аспиратора, чтобы предотвратить преждевременную отслойку нейронных кластеров. Кроме того, обогащайте среду MN ламинином 1 мкг/мл один раз в неделю для дальнейшего усиления прикрепления нейронов к культуральным планшетам.

Таблица 1: Культуральная среда

Название носителя	Реагентов	Концентрации
Нейронная среда дифференцировки (NDM)	Нейробазальный L-глютамин Заменимые аминокислоты Дополнение N - N2 Supplement Пенициллин/стрептомицин	1x 100x 100x 100x в 100 раз
Среда дифференцировки моторных нейронов	Среда нейронной дифференцировки Аскорбиновая кислота Puromorphamine Нейротрофический фактор головного мозга Цилиарный нейротрофический фактор Инсулиноподобный фактор роста 1 Нейротрофический фактор глиальной клеточной линии Ретиноевая кислота Соединение E Дополнение B - B27 Дополнение	1x 0,4 мкг/мл 1 мкМ<бр/> 10 нг/мл 10 нг/мл 10 нг/мл 10 нг/мл 1 мкМ<бр/> 125 нМ<бр/> В 50 раз

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 см стерильные тарелки для культивирования	сокол	353003
Заменимые аминокислоты (NEAA)	Термофишер	11140050	Рабочая концентрация 100x
Добавка N - N2 Добавка	Термофишер	17502048	Рабочая концентрация 100x
L-глютамин	Термофишер	No 25030	Рабочая концентрация 100x
Нейробазальный	Термофишер	21103049	Рабочая концентрация 1x
Ретиноевая кислота (РА)	сигма	Р2625	Растворите 100 мг в 3,3 мл ДМСО, чтобы получить 100 мл стокового раствора. Залейте в запас 100 μл/тубу и заморозьте при -80 ºC. Возьмите 200 мкл 100 мМ бульона и разбавьте в 10 раз (добавьте 1,8 мл ДМСО), чтобы получить 10 мМ бульона. Аликвота 50 μл/туба и хранить при -80 ºC. Разбавить до 1:10000 для использования. (рабочая концентрация 2 мкМ).
Полиорнитин (PLO)	Сигма-Олдрич	П3655	Растворите 100 мг в 1 мл ddW, чтобы получить 100 мг/мл исходного раствора. Разложите поголовье по 100 мкл пробирок. (рабочая концентрация 100 мкг/мл)
Ламинин	Термофишер	No 23017-015	Исходный раствор 1 мг/мл, рабочая концентрация 10 мкг/мл (покрытие), 1 мкг/мл (клеточные среды)
Аскорбиновая кислота (ASAC)	сигма	А4403	Растворите 100 мг в 250 мл dH2O, чтобы получить запас 0,4 мг/мл. Стерильно отфильтровать через фильтр 0,22 мкм, аликвотировать и заморозить при -80 ºC. Разбавить до 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 0,4 мкг/мл).
Цилиарный нейротрофический фактор (CNTF)	Пепротех	450-13	Растворите 100 μг в 1 мл стерильного PBS, а затем добавьте 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS до 10 μг/мл. Аликвот и заморозьте при -80 ºC. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Соединение Е	Абкам	АБ142164	Растворите 250 мкг в 2,0387 мл ДМСО, чтобы получить запас 250 мкм. Аликвотировать и заморозить при -80 ºC. Развести 1:2000 для использования. (рабочая концентрация 125 нМ).
DMEM/F12	Термофишер	113300	Рабочая концентрация 1x
Нейротрофические глиальные клеточные линии (GDNF)	Пепротех	450-10	Растворите 100 мкг в 1 мл PBS до 100 мкг/мл, а затем добавьте 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS до 10 мкг/мл. Аликвот и заморозьте при -80 ºC. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Ингибитор ROCK-I	Пепротех	1293823	Растворите 5 мг в 1480 мкл dH2O, чтобы получить 10 мМ запаса, аликвоту и заморозьте при -80 ºC. Разбавьте при 1:500 для использования. (рабочая концентрация 20 мкМ).
Карандашлин/Стрептомицин	Термофишер	15140122	Рабочая концентрация 100x
Пурморфамин (ПМН)	Миллипор-Сигма	540223	Растворите 5 мг в 9,6 мл ДМСО, чтобы получить 1 мл раствора. Аликвоту и заморозьте при -80 ºC. Разбавьте 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 1 мкМ).
Рекомбинантный нейротрофический фактор человеческого мозга (BDNF)	Пепротех	450-02	Ненадолго центрифугируйте перед восстановлением. Растворите 100 мкг в 1 мл PBS до 100 мкг/мл, а затем добавьте 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS до 10 мкг/мл. Аликвот и заморозьте при -80 ºC. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1)	Системы НИОКР	291-Г1-200	Растворите 200 мкг в 2 мл PBS до 100 мкг/мл, затем добавьте 18 мл 0,1% BSA-PBS для получения 10 мкг/мл и храните при -80 ºC. Аликвоту и заморозьте при -80 ºC. Разбавьте 10 мкг/мл в соотношении 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Нейротрофические глиальные клеточные линии (GDNF)	Пепротех	450-10	Растворите 100 мкг в 1 мл PBS до 100 мкг/мл, а затем добавьте 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS до 10 мкг/мл. Аликвот и заморозьте при -80 ºC. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Ретиноевая кислота (РА)	сигма	Р2625	Растворите 100 мг в 3,3 мл ДМСО, чтобы получить 100 мл стокового раствора. Залейте в запас 100 μл/тубу и заморозьте при -80 ºC. Возьмите 200 мкл 100 мМ бульона и разбавьте в 10 раз (добавьте 1,8 мл ДМСО), чтобы получить 10 мМ бульона. Аликвота 50 μл/туба и хранить при -80 ºC. Разбавить до 1:10000 для использования. (рабочая концентрация 2 мкМ).
Соединение Е	Абкам	АБ142164	Растворите 250 мкг в 2,0387 мл ДМСО, чтобы получить запас 250 мкм. Аликвотировать и заморозить при -80 ºC. Развести 1:2000 для использования. (рабочая концентрация 125 нМ).
Дополнение B - B27 Дополнение	Термофишер	21985023	Рабочая концентрация 50x
Стерильные колпаки для клеточных культур	Компания «Бейкер	СГ-600
Настольная центрифуга для клеточных культур	ТермоФишер	75004261	Sorvall Legend X1R
Водяная баня	ТермоФишер	No 2332	Изотемп
Инкубатор для клеточных культур с контролируемой влажностью	ТермоФишер	370	установка на 37 ºC, 5 % CO2

»