Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка
- Препараты для выделения CGNP (предшественника зернистых нейронов мозжечка)
- Организуйте соответствующее спаривание мышей для получения животных P5-P7 для выделения мозжечка (3-5 животных на ChIP и кондицию).
- Приготовьте HBSS/глюкозу, добавив 6 мг/мл глюкозы в буфер HBSS.
- Приготовьте среду для культивирования клеток CGNP (CGM) путем добавления 1 % (v/v) добавки N2, 1 % (v/v) пенициллин-стрептомицина-неомицина, 25 mM KCl и 10 % FCS к DMEM-F12. Для выращивания CGNP готовят среду CGM без FCS, но с содержанием 0,6 мкг/мл звукового ежа (SHH) (CGM-SHH) и при необходимости уравновешивают ее до 37 °C.
- Покрыть 6-луночные клеточные культуральные планшеты поли-D-лизином 100 мкг/мл в течение 1-2 ч в ЛТ для удаления глиа-клеток. После этого дважды вымойте стерильным ддН2О и дайте пластинам высохнуть. Храните тарелки не более одной недели при температуре 4 °C.
- Для культивирования CGNP покрыть 6-луночные клеточные культуральные планшеты поли-L-орнитином (0,1 мг/мл) при температуре 4 °C в течение ночи. После этого дважды промойте H2O для клеточной культуры и дайте планшетам высохнуть.
заметка: Пластины можно хранить не более одной недели при температуре 4 °C.
- Приготовьте 0,025 % трипсина (w/v) в HBSS/глюкозе и при необходимости уравновесьте его до 37 °C.
- Выделение нейронных предшественников из ткани головного мозга
- Выделение и факультативное культивирование CGNP (предшественников мозжечковых зернистых нейронов)
- Усыпляйте животных P5-7 путем обезглавливания с помощью ножниц. Снимите кожу головы, вскройте череп и удалите мозг с помощью небольших ножниц и щипцов. Изолируйте мозжечок и переведите его на ледяной HBSS/глюкозу. Удалите все мозговые оболочки и кровеносные сосуды и перенесите мозжечок в пробирки объемом 15 мл, заполненные холодным HBSS/глюкозой.
- Промойте мозжечок три раза 10 мл ледяного HBSS/глюкозы (соберите их центрифугированием при 650 x g в течение 5 минут при 4 °C) и затем гомогенизируйте мозжечок, осторожно пипетируя вверх и вниз пипеткой объемом 1 мл (максимум 2-3 раза), чтобы получить 0,5-1 мм3 фрагмента.
- Добавьте 5 мл 0,025% трипсина в HBSS/глюкозу и инкубируйте ткань при постоянном перемешивании на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15 мин. Остановите пищеварение, добавив 5 мл CGM, и соберите ткань центрифугированием при 650 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и растирайте ткань с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл в 1 мл CGM и переложите его в новую пробирку объемом 15 мл.
заметка: Важно избегать появления пузырьков воздуха.
- Добавьте 5 мл CGM и инкубируйте смесь в течение 2 минут на льду до образования остатков тканей. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку объемом 15 мл. Добавьте 2 мл НМГ в остаточную ткань и повторите процедуру растирания.
- Объедините надосадочную жидкость (без остатков тканей, всего около 10 мл) и центрифугируйте при 650 x g в течение 5 мин при 4 °C для сбора клеток мозжечка. Повторно суспендируйте гранулу в 10 мл CGM.
- Поскольку астроциты прилипают к поли-D-лизину быстрее и сильнее, чем CGNP, поместите клетки на 6-луночные планшеты, покрытые поли-D-лизином с концентрацией 100 мкг/мл (до 4 мл на лунку) и инкубируйте в течение 20 мин при 37 °C для удаления астроцитов.
- Встряхните тарелку и соберите надосадочную жидкость. Затем центрифугируйте при 650 x g в течение 5 мин при 4 °C в пробирке объемом 15 мл. Повторно суспендируйте гранулу в 10 мл CGM и подсчитайте клетки с помощью счетной камеры Нейбауэра.
заметка: CGNP круглые, маленькие и демонстрируют ореол при визуализации с помощью фазово-контрастной микроскопии.
- При необходимости засейте клетки в предварительно нагретый до температуры 37 °C CGM на пластины, покрытые поли-L-орнитином покрытием (3 x 106 клеток на 6-лунку) и инкубируйте их при 37 °C, 5%CO2 и 100% относительной влажности><.
заметка: Если оставить НМГ на пластинах (а вместе с ним и FBS), это приведет к дифференцировке CGNP в мозжечковые зернистые нейроны (CGN).
