1. Генерация органоидов коры головного мозга (Рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе протокола будут выполняться в колпаке биобезопасности класса 2, если не указано иное.
- Индукция 2D нейроэктодермальных колоний из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) в 2D культуре (дни с -1 по 3)
- Перед индукцией колоний hPSC наносят на матрицу базальной мембраны эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) в 6-луночный планшет с плотностью 20%-30%. Достигайте этой плотности путем пропускания колоний hPSC из одной лунки 6-луночной пластины при 60% слиянии в три лунки 6-луночной пластины.
- Для покрытия матрицы базальной мембраны разбавьте матрицу базальной мембраны в соотношении 1:50 в простой базальной среде. Равномерно внесите 1 мл/лунку 6-луночного планшета, инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре (RT), а затем аспирируйте.
- Поддерживайте колонии hPSC в течение 1 дня в 2 мл бессывороточной среды для культивирования клеток до дифференцировки.
- В день дифференцировки hPSC осмотрите колонии hPSC с помощью светлопольной микроскопии с увеличением от 4 до 10 раз, чтобы убедиться в здоровых колониях без обнаруживаемой дифференцировки.
заметка: Здоровые ПСК образуют плотные краевые колонии с клетками, которые имеют большое ядро, очень маленькую цитоплазму и выступающие ядрышки. Дифференцированные колонии iPSC будут демонстрировать явные морфологические отличия от описанных выше колоний hPSC, особенно вокруг внешних краев колоний или в центре.
- Добавьте реагенты, перечисленные в таблице 1, чтобы составить среду N2, необходимую для дифференцировки. Перед использованием доведите это средство до температуры RT.
- После проведения ЛТ аспирируйте бессывороточную среду для культивирования клеток из каждой лунки 6-луночного планшета и замените ее 2 мл среды N2, аккуратно добавленной серологической пипеткой объемом 5 мл.
- Добавьте двойной супрессор матерей против ингибиторов декапентаплегии (SMAD), SB-431542 (10 мкМ) и LDN 193189 (100 нМ).
заметка: Ингибиторы SMAD могут быть добавлены в среду N2 после того, как среда была помещена в каждую лунку, или в необходимое количество среды N2 перед заменой среды для культивирования клеток, не содержащей сыворотки. Ингибиторы можно равномерно вводить в среду путем осторожного вращения пластины или переворачивания трубки, содержащей среду и ингибиторы, 3-4 раза.
- В течение следующих 2 дней в каждую лунку ежедневно добавляйте свежие среды N2 с добавлением SB-431542 (10 мкМ) и LDN 193189 (100 нМ).
заметка: Свежая среда N2 добавляется для снижения длительного воздействия на клетки диметилсульфоксида (ДМСО), который используется для растворения 193189 соединений SB-431542 и LDN и предотвращения цитотоксичности.
- Генерация 3D нейроэктодермальных сфероидов из индуцированных 2D нейроэктодермальных колоний (дни с 3 по 7)
- Подтяните индуцированные нейроэктодермальные колонии с помощью диспазы, следуя шагам 1.2.2-1.2.8.
- Сначала удалите 2 мл среды N2 с 6-луночного планшета и промойте 1 раз HBSS, чтобы убедиться, что вся среда N2 удалена><.
заметка: Среда N2 может нарушать ферментативную активность диспазы, препятствуя адекватному отслоению нейроэктодермальных колоний от лунки.
- Добавьте 1 мл раствора 2,4 ед/мл в каждую лунку, содержащую колонию.
- Инкубируйте лунку в течение 20-25 минут (максимум 30 минут) при температуре 37 °C. Регулярно проверяйте наличие отслоения колонии.
заметка: Небольшие колонии могут отделиться в течение 20 минут. Любые колонии, которые остаются застрявшими после 30 минут, следует игнорировать.
- После инкубации добавьте в лунку 1 мл среды N2, чтобы остановить активность фермента dispase, и перенесите колонии в пробирку объемом 15 мл с помощью наконечника для пипетки P1000 с широким отверстием или модифицированного наконечника для пипетки P1000, разрезанного стерильными ножницами (что делает его наконечником P1000 с широким отверстием).
- Дайте колониям опуститься на дно пробирки под действием силы тяжести.
заметка: Этот процесс займет примерно 1 минуту.
- Как только комки опустятся, осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью стандартного наконечника для дозатора P1000 и замените его 1 мл свежей среды N2. Повторите этот шаг промывки три раза, чтобы обеспечить полное удаление отходов.
заметка: Любая оставшаяся диспа предотвратит равномерное образование нейроэктодермальных сфероидов и вызовет гибель клеток.
- После промывания ресуспендируйте клеточные скопления в 3 мл среды N2, переложите в одну лунку 6-луночного планшета и добавьте 40 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF).
заметка: Если большое количество нейроэктодермальных колоний было отделено, эти колонии могут быть размещены в двух или более лунках 6-луночного планшета для предотвращения слияния сфероидов. Через 24 ч после отделения колоний проверьте, не образовались ли сфероиды.
- Поддерживайте сфероиды в той же среде в течение следующих 3-4 дней, но добавляйте свежий bFGF (40 нг/мл) в каждую лунку ежедневно, чтобы способствовать пролиферации нейроэктодермальных клеток, самоорганизации, а также индуцировать и расширять нейроэпителии><.
заметка: Если сфероиды были покрыты с более высокой плотностью, среда, вероятно, станет желтой и потребует замены каждые 2 дня на свежую bFGF (40 нг/мл). Тем не менее, это не рекомендуется, и вместо этого следует поддерживать меньшее количество сфероидов в каждой скважине, чтобы избежать этой проблемы. Сфероиды могут быть внедрены в матрикс базальной мембраны через 3 дня, если нейроэпителии очевидны. Если нейроэпителии не заметны или не выглядят сильными, то сохраните сфероиды еще на сутки и проверьте еще раз.
Таблица 1: N2 Medium. В таблице перечислены реагенты, необходимые для приготовления среды N2.
| Компоненты мультимедиа | концентрация |
| DMEM Питательная смесь F12 10x 500 мл (DMEM/F-12) | |
| N2 Supplement 5 мл (100x) | Добавлено по ставке 1% |
| B 27 Добавка 10 мл | Добавка под 2% |
| Раствор заменимых аминокислот MEM (100x) | Добавка под 1% |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) | Добавка под 1% |
| 2-Меркаптоэтанол 50 мл (1000x ) | Добавка по 0,1% |
