$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка диссекционного материала, питательных сред, микрофлюидных устройств
- Автоклавные микродиссекционные щипцы и ножницы (121 °C, время стерилизации: 20 мин) и храните их в стерильном контейнере.
- Стеклянные покровные стекла (24 мм x 24 мм) простерилизовать путем инкубации в 1 М HCl в течение 24 часов на орбитальном шейкере при температуре 37 °C. Промыть их трижды стерильным, дистиллированным H2O и трижды этанолом 99%. Затем высушите покровные стекла при температуре 37 °C или под стерильным вытяжным колпаком. Наконец, проведите автоклавирование или подвергните покровные стекла воздействию ультрафиолетового излучения (30 минут) для завершения стерилизации. Чехлы затем можно хранить в этаноле до 70%.
- С помощью стерильных щипцов осторожно извлеките изолирующие устройства AXIS Axon Isolation Devices из упаковки и поместите их в стерильную чашку Петри.
- С помощью стерильного биопсийного перфоратора (ø: 1 мм) создайте по одному отверстию на каждый образец для культивирования (рис. 1) в соответствии с камерами для культивирования.
заметка: Не пробивайте слишком близко к микроканавкам, так как они могут быть повреждены под давлением.
- Простерилизуйте изолирующие устройства AXIS Axon, погрузив их в этанол на 70%. Затем полностью высушите изолирующие устройства AXIS Axon Isolation Devices и покровные стекла под стерильным проточным колпаком. Подождите минимум 3 часа, прежде чем продолжить.
заметка: Неполная сушка приведет к дефектной сборке микрофлюидных устройств.
- Поместите каждую покровную крышку в чашку Петри диаметром 35 мм или в лунку в 6-луночной пластине.
- Поместите изолирующее устройство AXIS Axon Isolation Device на покровное стекло и аккуратно, но сильно прижмите щипцами с загнутыми концами, чтобы обеспечить полное сцепление между изолирующим устройством и стеклянным покровным стеклом.
- В каждую камеру для культивирования пипетку ввели 150 мкл поли-D-лизина (0,1 мг/мл в стерильном, дистиллированномН2О). Поместите микрофлюидные устройства в вакуум на 5 минут, чтобы удалить весь воздух из камер для культивирования.
- Если в камерах все еще виден воздух, повторно направьте раствор поли-D-лизина в камеры.
- Инкубируйте устройства с поли-D-лизином O/N при 37 °C.
- Промыть камеры трижды стерильным, дистиллированным Н2О.
- Заполните камеры рабочим раствором ламинина по 150 мкл (Sigma-Aldrich, 5 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS) или бессывороточной среде) и инкубируйте O/N при 37 °C.
- Приготовьте 50 мл среды для культур тройничных ганглиев со следующим составом: 48 мл нейробазальной среды, 1 мл В-27, 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 5 нг/мл фактора роста нервов (НГФ), 0,25 пМ цитозина арабинозида.
- Приготовьте 50 мл среды для культур зародышевых зубов со следующим составом: 40 мл Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)-F12, 10 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS, конечная концентрация: 20%), 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 150 мкг/мл аскорбиновой кислоты.
2. Генерация и рассечение эмбриона мыши
- Определите возраст эмбриона на основе вагинальной пробки (вагинальная пробка: эмбриональный день развития 0,5, E0,5) и подтвердите его с помощью морфологических критериев. Для этого протокола мы обычно используем эмбрионы мышей E14.5-E17.5.
- Очистите область вскрытия и стереоскоп этанолом 70%.
- Принесите в жертву беременную мать через вывих шейки матки. Расположите шею мыши между первым и вторым пальцами на сетке, и решительно потяните за хвост.
- Рассеките кожу вокруг нижней части живота и вскройте живот с помощью ножниц. Расположение матки: на поздних сроках беременности матка обильно заполняет брюшную полость.
- Рассеките матку и поместите ее в пробирку, наполненную PBS на льду. Находясь на льду, ткань можно оставить на несколько часов. Выбросьте труп матери в соответствии с рекомендациями учреждения.
- Отделите эмбрионы от матки и освободите их от внеэмбриональных тканей. Поместите эмбрионы в PBS на лед.
- Обезглавьте эмбрионы с помощью ножниц и отделите нижнюю челюсть от остальной части головы с помощью ножниц для микродиссекции (рис. 2А). Удалить нижнюю челюсть аккуратно, не повреждая ганглии тройничного нерва; Так как последние локализуются в непосредственной близости от нижней челюсти, возможно их случайное повреждение. Сохраняют нижнюю челюсть и остальную часть головы в холодном ПБС, на льду.
- Чтобы вскрыть ганглии тройничного нерва (ТГ), возьмите голову и положите ее на стеклянную чашку Петри, предварительно заполненную холодной ПБС. С помощью щипцов удалите кожу и череп. Затем удалить конечный мозг и мозжечок, поместив щипцы ниже конечного мозга и подтянуть; Конечный мозг и мозжечок будут переворачиваться вместе, оставляя нижнюю часть черепа открытой.
- Локализовать ганглии тройничного нерва (рисунок 2В). Используйте щипцы для отделения ТГ от тройничных нервов. Устраните остатки выступов тройничного нерва, используя иглы для рассечения в качестве ножей. Поместите рассеченные ТГ в чашку Петри, наполненную холодной ПБС, и держите их на льду.
- Чтобы препарировать эмбриональные зубы, поместите нижнюю челюсть, предварительно отделенную от черепа, на стеклянную чашку Петри, заполненную холодной PBS. Используя иглы для рассечения в качестве ножей, удалите язык и кожу вокруг челюсти. Разделите левую и правую получелюсти, разрезав по средней линии челюсти. Зачатки зубов хорошо видны, как показано на рисунке 2C. Изолируйте зачатки зубов с помощью игл для вскрытия и удалите излишки незубных тканей. Поместите рассеченные зубные зачатки в чашку Петри, наполненную холодной PBS, и держите их на льду.
3. Микрофлюидные культуры
- После вскрытия удалите ламинин из микрофлюидных аппаратов. Заполните камеры 200 μл соответствующей среды.
- С помощью щипцов аккуратно перенесите рассеченные ТГ и зачатки зубов в отверстия, созданные пробивкой (Рисунок 2D). Следите за тем, чтобы зубные зачатки не плавали и тонули до тех пор, пока не соприкоснутся с покровными стеклами.
- Образцы культивируют в инкубаторе при 37 °C, 5%CO2.
- Меняйте питательную среду каждые 48 часов. Не опорожняйте камеры полностью и не делайте пипетку непосредственно в камеры для культивирования.
Полное опорожнение камер привело бы к образованию пузырьков воздуха в камерах; Прямое пипетирование в камеру приведет к повреждению аксонов. Чтобы избежать этих проблем, удалите среду, направив пипетку на внешнюю сторону лунок; Аналогично пипеткой подавайте свежую среду со стороны лунок, расположенных напротив камер.
- Кокультуры могут быть легко визуализированы с помощью покадровой микроскопии в течение периода культивирования и могут сохраняться более 10 дней.
- После периода культивирования промойте камеры, пипетируя 150 мкл PBS в одну лунку на камеру и давая PBS течь через камеры три раза.
- Удалить PBS и зафиксировать образцы путем пипетирования 150 мкл параформальдегида 4% (в PBS) в одной лунке на камеру; инкубировать при RT в течение 15 мин. Дважды промыть камеры PBS, как описано в 3.6.
- Приступайте к дальнейшему анализу.
