$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1A, B показана схема предварительно собранной микросхемы циклического сополимера олефинов (COC), включая расположение основных каналов или отсеков, лунок и микроканавок. Компартментализированный чип может создавать различные флюидные микросреды внутри компартмента, о чем свидетельствует выделение пищевого красителя (рис. 1C).
1. Покрытие многокамерных чипов для hSC-нейронов
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2A показан обзор процедур нанесения покрытий.
- Растворите поли-L-орнитин в дистиллированной воде, пригодной для клеточных культур, с получением 600 мкл раствора на чип рабочего раствора с концентрацией 20 мкг/мл.
- Аспирируйте оставшийся фосфатно-солевой буфер (PBS), оставшийся после подготовки чипса из лунок. При аспирации следите за тем, чтобы кончик пипетки находился вдали от отверстия канала.
заметка: Микрофлюидные каналы должны оставаться заполненными в течение всей этой процедуры. Не отсасывайте жидкость из каналов/отсеков, только из лунок.
- Загрузите 150 мкл рабочего раствора поли-L-орнитина в верхнюю правую лунку. Подождите 90 секунд или пока жидкость начнет заполнять нижнюю правую лунку. Добавьте 150 μл фильтрующего материала в нижнюю правую лунку и подождите 5 минут, чтобы жидкость прошла через микробороздки.
- Добавьте 150 мкл среды в верхнюю левую лунку. Подождите 90 с, а затем добавьте 150 мкл в левый нижний лунок. Оберните держатель чипа (чипов) парапленкой и поместите на ночь при температуре 4 °C.
заметка: В качестве альтернативы поместите чип и держатель при температуре 37 °C на 1 час.
- Отсасывайте среду из лунок, следя за тем, чтобы наконечник пипетки располагался подальше от отверстия канала. Добавьте 150 μL стерильной воды в верхнюю правую лунку. Подождите 90 с, а затем добавьте 150 мкл в нижнюю правую лунку. Подождите 5 минут, чтобы жидкость прошла через микробороздки.
- Добавьте 150 μL стерильной воды в верхнюю левую лунку, подождите 90 с, а затем добавьте еще 150 μL в левую нижнюю лунку.
- Повторите шаги 1.5-1.6.
- Медленно разморозьте ламинин при температуре от 2 °C до 8 °C и приготовьте рабочий раствор в концентрации 10 мкг/мл.
- Загрузите 150 μл рабочего раствора ламинина в верхнюю правую лунку. Подождите 90 секунд или пока жидкость начнет заполнять нижнюю правую лунку. Пипетируйте 150 мкл в нижнюю правую лунку. Подождите 5 минут, чтобы ламинин прошел через микробороздки.
- Добавьте 150 мкл ламинина в верхнюю левую лунку. Подождите 90 с, а затем добавьте 150 мкл в левый нижний лунок. Инкубируйте чип в держателе в течение 2 часов при температуре 37 °C.
- Промойте чип PBS (без Ca2+ и Mg2+). Загрузите 150 мкл PBS в верхнюю правую лунку. Подождите 90 секунд или пока жидкость начнет заполнять нижнюю правую лунку. Добавьте 150 μL PBS в нижнюю правую лунку и подождите 5 минут, чтобы PBS прошел через микроканавки.
- Пипируйте 150 мкл PBS в верхнюю левую лунку. Через 90 с пипетку 150 мкл в левую нижнюю лунку.
- Отсадите PBS из чипа, а затем промойте чип фильтрующим материалом NSC (см. Таблицу материалов). Загрузите 150 мкл среды в верхнюю правую лунку. Через 90 с или когда жидкость пройдет через правый канал в нижнюю правую лунку, добавьте 150 мкл в нижнюю правую лунку. Подождите 5 минут, чтобы фильтрующий материал протек через микроканавки.
- Добавьте 150 μL среды в верхнюю левую лунку и еще 150 μL в нижнюю левую лунку. Инкубируйте чип в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 для предварительного кондиционирования чипа до тех пор, пока он не будет готов к посеву NSC.
заметка: При необходимости стружку можно предварительно кондиционировать в течение ночи.
2. Засеивание NSC в микросхему с несколькими отсеками
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовались коммерчески приобретенные НСК, в отличие от нашей предыдущей публикации, которая начиналась с человеческих эмбриональных стволовых клеток. В этом протоколе нейральные стволовые клетки помещаются непосредственно в пластиковые чипы, где они дифференцируются в нейроны. Клеткам можно позволить пролиферировать в виде НСК (без дифференцировки) до 2 проходов и хранить во флаконах в жидкости N2 для дальнейшего использования. В этом протоколе используются флаконы NSC, хранящиеся в жидкости N2 после прохода 1 или 2. На рисунке 2B показан обзор процедур нанесения покрытий.
- Разморозьте НСЦ в соответствии с инструкциями производителя.
заметка: Эта процедура применяется к НСК, производным от H9. Для других клеточных линий потребуется оптимизация плотности клеток.
- Подсчитайте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра и отрегулируйте с помощью среды NSC, чтобы получить концентрацию 7 x 106 клеток на мл.
- Отсаживайте среду из каждой лунки чипа. Избегайте аспирации медиа из основных каналов.
- Пипетируйте 5 мкл клеточного раствора в верхнюю правую лунку, затем 5 мкл в нижнюю правую лунку (всего 70 000 клеток). Убедитесь, что клетки расположены пипетками по направлению к отверстиям основных каналов. С помощью микроскопа проверьте, что клетки попали в канал. Подождите 5 минут, пока ячейки прилипнут к нижней части чипа.
заметка: Для тензодатчиков можно использовать один или оба отсека.
- Пипетируйте ~150 мкл среды NSC в верхнюю правую лунку, а затем 150 мкл в нижнюю правую лунку. Повторите с левой стороны. Инкубировать при 5%CO2, 37 °C в подходящем увлажненном контейнере.
- Через 48 часов отсадите среду NSC из лунок и замените ее средой нейронной дифференцировки, добавив по 150 мкл в каждую верхнюю лунку и каждую нижнюю лунку.
- Культивируйте нейроны в инкубаторе с 5%CO2, 37 °C в подходящем увлажненном контейнере.
