$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление растворов
- Готовят раствор для диссоциации тканей из стерильного фенолового красного, содержащего фосфатно-солевой раствор Дульбекко (DPBS) с папаином (100 Ед/мл), цистеином (0,2 мг/мл) и дезокосибонуклеазой (ДНКаза, 250 Ед/мл).
- Для приготовления раствора ДНКазы разведите 100 мг лиофилизированного порошка ДНКазы I (один флакон) в 50 млН2О. Хорошо перемешайте и процедите исходный раствор. Подготовьте 10 мл бульонных аликвот. Разделите одну пробирку на 0,5 мл одноразовых аликвот. Храните эти одноразовые аликвоты при температуре -80 °C.
- Реагенты для магнитной сепарации готовят путем приготовления буфера с магнитной колонкой X: 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
- Для приготовления нейросферной среды используют нейробазальную среду, содержащую пенициллин/стрептомицин с L-глутамином и содержат 2% B27, 20 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста (EGF) и 20 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (bFGF).
- Для приготовления дифференцировочной среды используйте нейробазальную среду и добавьте 10 нг/мл дифференцированного фактора роста тромбоцитов (PDGF-AA) или 10 нг/мл ингибиторного фактора лейкемии (LIF) и 2% B27.
- Используйте сверхнизкую насадку 12 лунок (3,5 см2) и 6 лунок (9,6 см2) культуральных планшетов.
2. Вскрытие мозжечка
- Обезболите детенышей мышей (P3-P7) изофлураном и обезглавьте с помощью хирургических ножниц.
- Опрыскайте отделенные головы детенышей 70% этанолом.
- Переложите каждую головку в пустую стерильную 10-сантиметровую посуду для культуры. Отделите кожу с помощью ножниц для микродиссекции, затем удалите череп, проведя ножницами сагиттально по средней линии.
- С помощью щипцов #7 отклейте кости черепа, начиная каудально от ствола мозга. Осторожно поднимите мозг с помощью шпателя, сохранив мозжечок нетронутым, и переложите мозг в свежую стерильную посуду размером 10,0 см, содержащую 15 мл ледяного раствора сбалансированной соли Хэнкса (HBSS).
- Поместите чашку с мозгом под микроскоп для вскрытия. С помощью тонких щипцов #5 удалите мозговые оболочки и крупные кровеносные сосуды из мозжечка и отделите мозжечок от ствола мозга с помощью шпателя.
- Перенесите мозжечок в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5,0 мл ледяного раствора HBSS. Промойте мозжечок, промыв и сцедив 3 раза 5,0 мл HBSS.
заметка: Каждый мозжечок должен быть помещен в отдельную пробирку для дальнейшей обработки.
3. Приготовление клеточной суспензии
- Поместите чашку с мозгом под микроскоп для вскрытия. С помощью тонких щипцов #5 удалите мозговые оболочки и крупные кровеносные сосуды из мозжечка и отделите мозжечок от ствола мозга с помощью шпателя.
- Перенесите мозжечок в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5,0 мл ледяного раствора HBSS. Промойте мозжечок, промыв и сцедив 3 раза 5,0 мл HBSS.
заметка: Каждый мозжечок должен быть помещен в отдельную пробирку для дальнейшей обработки.
- После последнего полоскания добавьте 5 мл раствора для диссоциации тканей на основе папаина, предварительно нагретого до 37 °C. Инкубируйте ткань в течение 15 минут при 37 °C на водяной бане. Медленно перемешивайте содержимое, переворачивая трубку вверх и вниз 3–5 раз каждые 3 минуты с помощью миксера или вручную.
- Подготовьте пипетку Пастера большого диаметра (обычная стеклянная пипетка) и узкого диаметра (отполированную огнем путем нагревания на горелке Бунзена), как описано ранее.
- Промойте салфетку 3 раза 5 мл раствора HBSS, не допуская потери ткани во время сцеживания вручную.
- Удалите последний раствор HBSS и добавьте в ткань 5 мл раствора DPBS, содержащего 250 мкл раствора ДНКазы. Диссоциируйте ткань путем растирания в 10–15 раз с помощью пипетки Пастера широкого диаметра. Выполняйте этот шаг аккуратно, чтобы избежать образования пузырьков.
- Затем инкубируйте суспензию еще 10 минут при температуре 37 °C на водяной бане, перемешивая, переворачивая и выпрямляя трубку.
- Используйте пипетку Пастера уменьшенного диаметра для дальнейшего растирания тканевой суспензии в 10 раз. Если остались большие кусочки ткани, осторожно прижмите кусочки ткани к дну пробирки кончиком пипетки и продолжайте пипетирование до тех пор, пока клетки не достигнут тонкой суспензии.
- Инкубируйте ткань при температуре 37 °C еще 10 минут, повторяя предыдущие этапы смешивания.
4. Иммуномаркировка стволовых клеток
- Поместите пробирки центрифуги на лед и используйте ледяные растворы для следующих шагов. Процедите диссоциированные клетки через клеточный фильтр 40 мкм в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Сверху на фильтр налейте 10,0 мл раствора HBSS, чтобы убедиться, что клетки проходят через сетку в этом дополнительном растворе.
- Переложите отфильтрованные клетки в свежую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клеточную суспензию при температуре 300 x g в течение 10 мин при 4 °C. Отсадите и полностью выбросьте надосадочную жидкость, осторожно используя вакуумный аспиратор.
- Ресуспендируйте гранулу в 160 мкл магнитного буфера для колонки. Чтобы получить суспензию одиночных клеток перед магнитным мечением, пропустите клетки через нейлоновую сетку толщиной 30 мкм, чтобы удалить клеточные комки, которые в противном случае могут закупорить колонку.
- Добавьте 40 мкл микрогранул анти-проминина-1 в каждую 15 мл пробирки, перемешайте и инкубируйте в холодильнике в течение 15 минут, чтобы антитело связалось с клетками, экспрессирующими проминин-1.
- Промойте клетки, добавив 1,0–2,0 мл колоночного буфера X, и центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость.
- Суспендировать гранулу в 1,0 мл колонного буфера X.
заметка: Если после ресуспендирования гранулы с 1,0 мл буфера X колонки видны небольшие комки, их следует осторожно удалить с помощью наконечника пипетки Пастера, в противном случае эти комки могут блокировать магнитную колонку во время сортировки клеток.
5. Подготовка магнитной колонки, сортировка ячеек и нанесение покрытий
ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитное разделение из разных состояний генотипа (болезнь или контроль) должно быть выполнено одновременно, так как любая задержка может повлиять на морфологию нейросферы.
- Подготовьте магнитные колонки, поместив их на магнитную подставку, подверженную воздействию магнитного поля. Промойте колонку один раз 500 мкл буфера X, добавив буфер, который капает в центрифужную трубку, которую нужно выбросить.
заметка: Готовьте свежий буфер магнитной колонки X для каждого эксперимента; Если нет, то выход стволовых клеток будет низким.
- Нанесите на столбец суспензию с меткой ячейки. Соберите проточные клетки, содержащие немеченые клетки, которые в основном состоят из нейронно-глиальных смешанных клеток мозжечка, в свежие пробирки объемом 15 мл (рис. 1A).
- Промойте колонку 3 раза 500 мкл буфера X (каждая промывка занимает около 2–4 минут).
заметка: Смешанная культура мозжечковых нейронов и глии, обогащенная мозжечковыми зернистыми нейронами, может служить полезным побочным продуктом этой стадии очистки.
- Извлеките колонку из магнитного поля и поместите ее в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте в колонку 1,0 мл питательной среды (нейросферной среды) и вдавите поршень в колонку, чтобы вымыть клетки, помеченные шариками проминина-1, в свежую пробирку сокола объемом 1,5 мл.
- Чтобы повысить чистоту метеных проминином-1 клеток, пропустите элюированные клетки через вторую колонку, следуя шагам 5.1–5.4.
- Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Типичный выход составляет10-7 клеток на мозжечок. Поместите клетки на планшеты со сверхнизким уровнем прикрепления (6 или 12 лунок, в зависимости от плотности, необходимой для последующих экспериментов).
6. Прохождение нейросфер и дифференцировка
- Тарелируйте меченые проминином-1 стволовые клетки на 12-луночных планшетах со сверхнизким присоединением в среде нейросферы (5000 клеток/лунку).
- Через 7–10 дней клетки делятся, образуя шарообразные плавающие нейросферы (первичные нейросферы).
заметка: В этом эксперименте генерируются вторичные нейросферы, которые расширяются в количестве, для дальнейшего использования. Первичные популяции нейросфер не используются для этих экспериментов, поскольку они могут содержать загрязняющие клетки, которые не обладают свойствами стволовых клеток и могут слипаться с нейросферами.
- Для пассирования первичные нейросферы вместе с питательной средой с помощью наконечников пипеток объемом 1,0 мл следует перенести в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Гранулируйте нейросферы центрифугированием при 300 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендировать гранулу в 5 мл тканевой диссоциативной среды, содержащей папаин или 0,05% раствор трипсина. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 10 минут.
- Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 мин. Ресуспендируйте клетки в 5 мл нейросферной среды и диссоциируйте клетки механически с помощью пластиковой пипетки Пастера и медленно пипетируйте вверх и вниз 10 раз.
- Поместите клетки (снова) в нейросферные среды, как описано ранее. После 7–10 дней в культуре пластину следует обогатить вторичными нейросферами.
заметка: Эти культуры могут быть пассированы до 8 раз с хорошей эффективностью, после чего размер нейросферы, как правило, уменьшается, что указывает на снижение пролиферации.
- Подсчитайте клетки на гемоцитометре и определите оптимальное количество для будущих экспериментов на пластинах, покрытых поли-D-лизином (6 или 12 лунок).
- Чтобы дифференцировать стволовые клетки, соберите нейросферы от второго до восьмого прохода центрифугированием, как описано ранее, за исключением добавления в гранулу среды для дифференцировки><.
заметка: После 7 дней in vitro стволовые клетки дифференцируются в нейроны, астроциты и олигодендроциты, что продемонстрировано окрашиванием нейрональным маркером β-III тубулином, астроцитарным маркером глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) и маркером олигодендроцитов O4.
