Кокультивирование ганглиозных нейронов сетчатки с обонятельной глией

Аннотация

Источник: Portela-Lomba, M., et al. Кокультура аксотомизированных ганглиозных нейронов сетчатки сетчатки крысы с обонятельной оболочечной оболочкой, как in vitro модель регенерации аксонов взрослого человека. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует процедуру выделения ганглиозных нейронов сетчатки (RGN) из сетчатки крысы и их совместного культивирования с клетками обонятельной глии (OEG). Этот метод позволяет изучить нейрорегенеративный потенциал ОЭГ после повреждения нервной системы.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Приготовление ihOEG (Ts12 и Ts14) для анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен за 24 часа до вскрытия RGN и кокультуры.

1. Покровные стекла с диаметром 12 мм обработать поли-L-лизином (ФАПЧ) 10 мкг/мл в течение 1 ч.<бр/> заметка: Покровные стекла можно оставить на ночь в растворе ФАПЧ.
2. Промойте покровные стекла 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS) три раза.
3. Отделите клетки Ts12 и Ts14 ihOEG от чашки для культивирования клеток p60.
   1. Добавьте 4 мл питательной среды DMEM/F12 (базальная среда)-FBS (фетальная бычья сыворотка) в коническую пробирку объемом 15 мл. Нагрейте до 37 °C на чистой водяной бане.
   2. Удалите среду из планшетов и промойте клетки 1 мл 1x PBS (фосфатно-солевой буфер)-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) один раз.
   3. Добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА в клетки OEG и инкубируйте в течение 3–5 мин при 37 °С, 5%_СО2.
   4. Соберите клетки пипеткой p1000 и перенесите их в среду, приготовленную на шаге 2.1.
   5. Центрифуга в течение 5 мин при 200 x g.
   6. Стремитесь к надосадочной жидкости.
   7. Добавьте 1 мл среды ME10 и повторно суспендируйте гранулу.
   8. Посчитайте количество клеток в гемоцитометре.
4. Засейте 80 000 клеток Ts14 или 100 000 клеток Ts12 в лунку на покровные стекла в 24-луночных планшетах в 500 мкл среды ME10.
5. Культивирование клеток при 37 °C в 5%_CO2 в течение 24 ч.

2. Рассечение ткани сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: 2-месячные самцы крыс Wistar используются в качестве источника RGN. Две сетчатки (одна крыса) на 20 лунок 24-луночной клеточной чашки. Автоклавный хирургический материал перед использованием. Набор для диссоциации папаина приобретается в продаже (Таблица материалов). Следуйте инструкциям поставщика услуг по восстановлению. Восстановите D, L-2-амино-5-фосфоновалеровую кислоту (APV) в бульоне 5 мМ и приготовьте аликвоты.

1. В день проведения анализа приготовьте следующие среды.
   1. Приготовьте чашку для клеточной культуры p60 с 5 мл холодного EBSS (сбалансированного раствора соли Эрла) (флакон 1 набора для диссоциации папаина).
   2. Приготовьте чашку для клеточной культуры p60 с восстановленным флаконом 2 (папаином) из набора для диссоциации папаина плюс 50 мкл APV. Затем добавьте 250 мкл восстановленного флакона 3 (ДНКаза плюс 5 мкл APV).
   3. В стерильной пробирке смешать 2,7 мл флакона 1 с 300 мкл флакона 4 (ингибитор альбумин-овомукоидной протеазы). Добавьте 150 мкл флакона 3 (ДНКазы) плюс 30 мкл APV.
   4. Приготовьте 20 мл среды Нейробазал-В27 (NB-B27).
2. Принести крысу в жертву путем удушения_СО2.
3. Удалите голову путем обезглавливания с помощью гильотины; поместите ее в чашку Петри диаметром 100 мм и опрыскайте голову этанолом 70% перед помещением в колпак с ламинарным потоком.
4. Обрежьте крысиные усы ножницами, чтобы они не мешали манипуляции с глазами.
5. Захватите зрительный нерв щипцами, чтобы вытащить глазное яблоко настолько, чтобы можно было сделать разрез поперек глаза с помощью скальпеля.
6. Удалите хрусталик и стекловидное тело и вытяните сетчатку (оранжевую ткань), в то время как остальные слои глаза (включая слой пигментного эпителия) остаются внутри.
7. Поместите сетчатку в чашку для клеточной культуры p60, приготовленную на шаге 2.1.1.
8. Перенесите сетчатку в чашку для клеточной культуры p60, приготовленную на шаге 2.1.2, и разрежьте ее скальпелем на небольшие кусочки размером примерно < 1 мм.
9. Переложите в пластиковую пробирку объемом 15 мл.
10. Инкубировать ткань в течение 30 минут во влажном инкубаторе при 37 °C при 5%_CO2, перемешивая каждые 10 минут.
11. Диссоциируйте клеточные сгустки путем пипетирования вверх и вниз с помощью стеклянной пастеровской пипетки.
12. Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение 5 минут.
13. Выбросьте надосадочную жидкость. Для инактивации папаина следует ресуспендировать клеточную гранулу в растворе, приготовленном на шаге 2.1.3 (1,5 мл на 2 глаза).
14. Тщательно отпижьте эту клеточную суспензию в 5 мл восстановленного флакона 4.
15. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин.
16. Во время центрифугирования полностью удалите среду ME-10 из 24-луночного ячеистого планшета OEG (предварительно подготовленного на шаге 1) и замените его 500 мкл среды NB-B27 на лунку.
17. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 2 мл среды NB-B27.
18. Нанесите 100 мкл суспензии клеток сетчатки на лунку пластины m24 на обработанные ФАПЧ или OEG монослои-покровные стекла.
19. Поддерживайте культуры при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 96 ч в среде NB-B27.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дополнение к B-27	Gibco	17504044
D,L-2-амино-5-фосфоновалеровая кислота	сигма	283967	Ингибитор NMDA-рецепторов
ДМЭМ-Ф12	Gibco	11320033	Среда для культивирования клеток
ФБС	Gibco	11573397	Фетальная бычья сыворотка
ФБС-Гиклон	Научный центр Фишера	16291082	Фетальная бычья сыворотка
L-глютамин	Лонза	БЭ17-605Ф
Нейробазальная среда	Gibco	21103049	Среда для культивирования нейрональных клеток
Система диссоциации папаина	Уортингтонская биохимическая корпорация	LK003150	Для использования при выделении нейронных клеток
ПБС	Домашнее изготовление
PBS-EDTA	Лонза	Х3БЭ02-017Ф
Пенициллин/Стрептомицин/Амфотерицин В	Лонза	17-745Э	Бактериостатические и бактерицидные
Экстракт гипофиза	Gibco	13028014	Экстракт гипофиза крупного рогатого скота
Поли-L-лизин (PLL)	сигма	А-003-М