Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Гелевые пятна внеклеточного матрикса
- За день до изоляции выполните следующие действия:
- Разморозьте аликвоту геля внеклеточного матрикса (100 μл) при 4 °C в течение не менее 1,5 ч. Разведите 1:10 в модифицированной среде Дульбекко с 4500 мг/л глюкозы, 4 мМ L-глутамина и 110 мг/мл пирувата натрия (DMEM). Гель из внеклеточного матрикса всегда должен нагреваться при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Резкие изменения температуры приведут к неравномерному покрытию и образованию кристаллов.
- Разбавленный раствор геля внеклеточного матрикса держать на льду 15 минут.
- Предварительно охладите микропипетку объемом 20 мкл в течение 10 минут.
- Поместите 8-луночные предметные стекла в чашку Петри диаметром 100 мм и перенесите чашку на холодную поверхность (например, в морозильную камеру) на 10 минут.
- С помощью предварительно охлажденной микропипетки нанесите в каждую лунку каплю геля с внеклеточным матриксом объемом 10 мкл. Подержите чашку Петри на холодной поверхности еще не менее 7 минут (рисунок 1А).
- Полностью удалите оставшийся гель из внеклеточного матрикса (рисунок 1B) и высушите лунки при температуре 37 °C в течение ночи.
2. Рассечение мышц головы (жевательной, двугастральной и levator veli palatinи)
- Перед вскрытием приготовьте 50 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) с добавлением 2% пенициллин-стрептомицина (P/S). Держите на льду.
- После эвтаназии одной молодой взрослой крысы (9 недель) с CO2/O2 обезглавить голову и снять кожу с головы. Переведите голову в ледяной PBS с добавлением 2% P/S в пробирке объемом 50 мл.
- Жевательная мышца (получена из 1-й жаберной дуги)
- Поместите голову одной стороной вверх на силиконовую подушечку и зафиксируйте ее иглами для подкожных инъекций (рисунок 2А).
- Определите околоушную железу и лицевой нерв (рисунок 2A). Обнажите глубокую фасцию, покрывающую железу. Разрежьте фасцию и удалите железу с помощью ножниц для препарирования. Определите наружный слуховой проход. Проведите лицевой нерв от стиломастовидного отверстия и аккуратно удалите височные, скуловые и щечные ветви лезвием скальпеля No 15.
- Освободите поверхностную головку жевательной мышцы, удалив фасцию. Определите как поверхностные, так и глубокие головки жевательной мышцы. Проследите за поверхностной головкой до тех пор, пока ее толстый сухожильный апоневроз не будет внедрен в скуловой отросток верхней челюсти.
- Отделите сухожилие от его начала в скуловом отростке с помощью прямых щипцов. Разрежьте его лезвием скальпеля No 15 или ножницами для препарирования и осторожно поднимите (рисунок 2Б).
- Рассекайте поверхностную головку жевательной мышцы до ее введения под углом и нижней половиной боковой поверхности ветви нижней челюсти лезвием скальпеля No 15 (рисунок 2В). Теперь полностью удалите мышцу.
- Задняя брюшная часть двужелудочной мышцы (происходит от 2-й бранхиальной дуги)
- Поместите голову в лежачем положении на силиконовую подушечку и зафиксируйте ее иглами для подкожных инъекций (рисунок 3А).
- Удалите подкожный жир, покрывающий как подъязычные, так и подчелюстные железы. Далее удалите поверхностную фасцию и железы с помощью ножниц для вскрытия. Обнажите двужелудочную мышцу (переднюю и заднюю части живота).
- Удерживайте переднее сухожилие заднего брюха прямыми щипцами, разрежьте его и тщательно рассекайте до тех пор, пока оно не окажется в барабанной булле (рисунок 3B). То же самое проделайте с контралатеральной стороной.
- Levator veli palatini мышца (происходит из 4-й бранхиальной дуги)
- После рассечения заднего брюшка двужелудочной мышцы локализовать подъязычную мышцу, оттянуть ее в сторону, и аккуратно удалить (рисунок 4А).
- Локализуйте сухожилие levator veli palatini, которое прикрепляется к барабанной булле (рис. 4A). Тщательно рассеките его и разрежьте с двух сторон.
- Обратите внимание на трахею и пищевод, который проходит за ней. Поднимите пищевод и обнажите глотку и гортань.
- Локализовать и рассечь область верхней глоточной констрикторной мышцы. Определите levator veli palatini и разрежьте его с обеих сторон (рис. 4B).
заметка: Непосредственно после вскрытия аккуратно удалите сухожилия и соединительную ткань из каждой мышцы под стереомикроскопом. Быстро погрузите все образцы в 70% этанол и перенесите их в ледяную PBS с добавлением 2% P/S в пробирке объемом 15 мл.
3. Изоляция сателлитных клеток (СК)
- Выполните следующие подготовительные мероприятия для выделения СК из трех групп мышц:
- Приготовьте 7,5 мл 0,1% проназы в DMEM. Отфильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм. Предварительно подогрейте раствор при температуре 37 °C на водяной бане в течение 10 минут перед изоляцией.
- Приготовьте 35 мл DMEM с добавлением 10% лошадиной сыворотки (HS) и 1% P/S. Также предварительно прогрейте до 37 °C на водяной бане.
- Приготовьте питательную среду объемом 15 мл, состоящую из DMEM с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10% HS, 1% P/S и 1% экстракта куриного эмбриона (CEE). Предварительно прогрейте до 37 °C на водяной бане.
- Предварительно смажьте шесть пластиковых пипеток (10 мл) HS и высушите не менее 10 минут перед использованием.
- В капюшоне для культуры переведите каждую мышцу в лунку 6-луночной пластины. С помощью ножниц для рассечения разрежьте мышцу небольшими кусочками примерно по 2 мм. Будьте осторожны, чтобы не измельчить ткань слишком сильно.
- Осторожно добавьте 2,5 мл 0,1% раствора проназы в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 60 мин. Осторожно встряхните тарелку через 20, 40 и 60 мин.<бр/>
заметка: Точная продолжительность инкубации зависит от таких факторов, как возраст и штамм животных.
- Следите за происходящим под микроскопом. Проверьте мышечные фрагменты и остановите ферментативное переваривание, когда пучки клетчатки кажутся ослабленными (Рисунок 5).
- Добавьте 2,5 мл DMEM с добавлением 10% HS и 1% P/S. Переложите в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте пробирки при 400 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации.
- Добавьте 5 мл DMEM с добавлением 10% HS и 1% P/S. Пипеткой подавайте раствор вверх и вниз с помощью пластиковой пипетки объемом 10 мл (растирание) не менее 20 раз для гомогенизации ткани.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 200 х г в течение 4 мин. Соберите надосадочную жидкость и переложите ее в пробирку объемом 15 мл.
- Добавьте 5 мл DMEM с добавлением 10% HS и 1% P/S. Снова пипетку с помощью пластиковой пипетки объемом 10 мл, пока фрагменты ткани не пройдут легко.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 200 х г в течение 4 минут и соберите надосадочную жидкость в пробирку объемом 15 мл.
- Поместите клеточный фильтр (40 мкм) на пробирку объемом 50 мл и перенесите надосадочную жидкость, содержащую диссоциированные клетки, на фильтр. Умойтесь 1 мл DMEM для максимального восстановления клеток.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 1000 x g в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Ресуспендируйте гранулу в питательной среде объемом 300 мкл и подсчитайте клетки в гемоцитометре.
4. Дифференцировка сателлитных клеток на гелевые пятна внеклеточного матрикса
- Клеточную суспензию разбавляют до получения 1,5 х 103 клеток в 10 мкл питательной среды.
- Закрепите крышки камерных стекол скотчем и отметьте пятна черным маркером на нижней стороне предметного стекла.
- С помощью микропипетки капните каплю клеточной суспензии объемом 10 мкл на гелевое пятно внеклеточного матрикса. Проверьте под микроскопом, правильно ли капля клеточной суспензии была размещена на месте. Инкубировать в течение шести часов при температуре 37 °C.
- Осторожно добавьте 400 μл питательной среды (DMEM с добавлением 20% FBS, 10% HS, 1% P/S и 1% CEE) и инкубируйте в течение трех дней при 37 °C.
заметка: На этом этапе только что изолированные СК подвергаются обширной травме (ферментативное переваривание и жесткое растирание) и нуждаются в восстановлении. Не тревожьте клетки в течение первых трех дней. Далее питательная среда может быть изменена в зависимости от типа эксперимента.
Гелевые пятна внеклеточного матрикса могут быть засеяны с высокой плотностью клеток (1,5-2,5 x 103/20 мкл) для дифференцировочного анализа. Питательную среду (DMEM с добавлением 20% FBS, 10% HS, 1% P/S и 1% экстракта куриного эмбриона) можно заменять каждые три дня.
