Нейрогенез, индуцированный ретиноевой кислотой, с использованием клеток эмбриональной карциномы мыши

Аннотация

Источник: Leszczyński, P., et al., Нейрогенез с использованием клеток эмбриональной карциномы p19 J. vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует простую технику нейрогенеза, индуцированного ретиноевой кислотой, в клетках эмбриональной карциномы мыши P19. Ретиноевая кислота активирует факторы транскрипции и запускает экспрессию генов для дифференцировки нейронов.

Протокол

1. Генерация агрегатов

1. Добавьте 5 μL RA (ретиноевой кислоты) (1 мМ запас, растворенный в 99,8% этаноле, хранящийся при -20 °C) к 10 мл дифференцировочной среды и хорошо перемешайте (конечная концентрация 0,5 μM RA).
   заметка: РА светочувствительна. Низкая концентрация этанола не влияет на дифференцировку клеток.
2. Добавьте 10 мл среды для дифференцировки (с RA) в 100-миллиметровую чашку для необработанных культур (предназначенную для суспензионной культуры).
3. Высейте 1 х 10⁶ ячеек в чашку диаметром 100 мм (площадь поверхности чашки 56,5 см2).
4. Поместите колбу с ячейками в инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 2 дня, чтобы способствовать образованию заполнителей.
5. Через 2 дня замените средство дифференцировки. Аспиратную среду, содержащую агрегаты, используют с помощью пипетки объемом 10 мл и переносят в пробирку объемом 15 мл в режиме ЛТ.
6. Дайте заполнителям осесть под действием силы тяжести в течение 1,5 минут при температуре RT.
7. Выбросьте надосадочную жидкость.
8. Добавьте свежую 10 мл среды для дифференцировки с 0,5 мкМ РА с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
   осторожность: Не пипетируйте клеточные агрегаты вверх и вниз.
9. Засейте заполнители в новую 100-миллиметровую чашку для необработанных культур (предназначенную для суспензионной культуры).
10. Поместите планшет в инкубатор (при температуре 37 °C и 5% CO₂) на 2 дня.

2. Диссоциация агрегатов

1. Аспирируйте клеточные агрегаты с помощью пипетки объемом 10 мл.
2. Переложите агрегаты в пробирку объемом 15 мл. Дайте агрегатам ячеек осесть под действием силы тяжести в течение 1,5 минут.
3. Удалите надосадочную жидкость.
4. Промойте агрегаты только DMEM (без сыворотки и антибиотиков).
5. Дайте заполнителям ячеек осесть путем осаждения под действием силы тяжести в течение 1,5 мин при RT.
6. Аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте 2 мл трипсина-ЭДТА (0,25%).
7. Поместите агрегаты клеток на водяную баню (37 °C) на 10 мин. Осторожно помешивайте агрегаты каждые 2 мин, постукивая рукой.
8. Остановите процесс трипсинизации, добавив 4 мл поддерживающей среды.
9. Пипетируйте агрегаты вверх и вниз 20 раз с помощью пипетки объемом 1 мл.
10. Центрифугируйте ячейки в течение 5 мин при 200 x g и RT.
11. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл поддерживающей среды.
12. Определите номер ячейки с помощью счетчика ячеек.

3. Гальванические ячейки

1. Добавьте 3 мл на лунку поддерживающей среды в 6-луночный планшет.
2. Затравочные клетки в 6-луночном культуральном планшете с плотностью 0,5 х 10⁶/лунка.
3. Инкубировать при 37 °C с концентрацией_CO2 5%.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) с L-глютамином	Лонза	БЭ12-604К
Этанол 99,8%	Чемпур	ХИМИЯ*613964202
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Евро	Э5050-03
Пенициллин/стрептомицин 10К/10К	Лонза	ДЭ17-602Э
Фосфатно-солевой буфер (PBS), 1x концентрированный без ионов кальция и магния	Лонза	БЭ17- 517К
Ретиноевая кислота	Сигма- Олдрич	Р2625-50МГ	Растворен в 99,8% этаноле, хранится при температуре -20 °C до 6 месяцев
Трипсин 0,25% - ЭДТА в ГБСС, без ионов кальция и магния, с фенолом красным	Биосера	ЛМ-Т1720/500
1 мл серологических пипеток	Профилаб	515.01 Стандарты 515.01
10 мл серологических пипеток	Профилаб	515.1
Чашка 100 мм, предназначенная для выращивания суспензии	Корнинг	C351029
Центрифужные пробирки объемом 15 мл	Сигма- Олдрич	CLS430791-500 шт.
5 мл серологических пипеток	Профилаб	515.05
6-луночный планшет	Корнинг	CLS3516
Колбы для клеточных культур, площадь поверхности 25 см квадратная	Сигма- Олдрич	CLS430639-200 шт.

См. Кабель