$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Культура эмбриональных фибробластов мышей (MEF)
- Приготовьте среду MEF, модифицированную среду Dulbecco Eagle's (DMEM, high-glucose), с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
- Покройте 100 мм чашки для клеточных культур 0,5% раствором желатина в течение 30 мин при комнатной температуре (ОТ).
- Подсчитайте MEF с помощью цитометра. Удалите желатиновый раствор и немедленно залейте предварительно подогретую до 37 °С среду MEF. Быстро разморозьте флаконы с обработанными митомицином С MEF на водяной бане 37 °C в течение 2 мин, затем засейте 2,8 x 106 MEF на 100 мм посуду, покрытую желатином. Соответствующим образом отрегулируйте количество ячеек, если используете посуду других размеров. Инкубируйте MEF в течение ночи при 37 °C, 5%CO2.
- Смените носитель на следующий день. Культивируйте в течение 2-3 дней до слияния слоя MEF.
2. Эмбриональные стволовые клетки мыши или культура ESC
- Приготовьте среду ESC, модифицированную среду Дульбекко (IMDM) от Iscove, дополненную 15% FBS и 103 Ед/мл ингибиторного фактора лейкемии (LIF), 0,1 мМ заменимых аминокислот, 55 мМ 2-меркаптоэтанола, пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), гентамицин (200 мкг/мл) и 0,2% микоплазменный антибиотик.
- Удалите среду MEF из блюда, приготовленного на шаге 1, и замените ее предварительно подогретой средой ESC с температурой 37 °C.
- Разморозьте флакон ESC и затравочные ячейки поверх слоя MEF. Инкубировать при 37 °C, 5%CO2, пока ESC не достигнут слияния.
- Приготовьте новые чашки для клеточных культур, содержащие сливающийся монослой MEFs. Чтобы пройти ЭСК, промойте один раз PBS и отсоедините 0,25% трипсина/ЭДТА на 2-5 минут при 37 °C, 5% CO2. Остановите трипсинизацию, добавив свежий IMDM с 15% FBS в отделяющиеся клетки, перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 160 x g в течение 5 минут при RT.
- Удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте ЭСК свежим IMDM и пропустите одну пятую клеток в каждую новую чашку, покрытую MEF; инкубируйте до тех пор, пока клетки не достигнут слияния (обычно 4-5 дней).
3. Изъятие MEF и культуральных ESC на пластинах, покрытых желатином
- Как только ЭКС достигнут слияния, отделите их и МЭФ с 0,25% трипсина/ЭДТА, как показано на шаге 2.4, повторно суспендируйте клетки в свежем IMDM, перенесите в неадгезивную бактериологическую чашку Петри и инкубируйте в течение 40 минут при 37 °C, 5%CO2.
- Осторожно перенесите ЭСК и среду, содержащую MEFs, на новую пластину, покрытую желатином, с помощью пипетки объемом 5 мл, избегая повторного пипетирования. Клетки, оставшиеся в чашках Петри, являются MEF, так как ESC не адгезируются.
- Прохождение ЭСК каждые 3-4 дня. Менее частое пассирование может снизить плюрипотентность ЭСК. Не превышайте 60% конфлюенции, так как это может способствовать дифференцировке.
- Повторите шаги 3.2-3.3 три раза или более, по мере необходимости, до тех пор, пока MEF больше не станут обнаруживаться микроскопом для клеточных культур с использованием объектива 20X, чтобы убедиться в отсутствии MEF.
- Проверьте плюрипотентность ЭСК путем проверки культуры ЭСК, чтобы увидеть, образуют ли клетки плотные колонии с типичной полигональной морфологией ЭСК (рис. 1A). Проверьте стволовость клеток с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (qRT-PCR), иммуноблоттинга или иммунофлуоресценции основных факторов транскрипции плюрипотентности (рис. 2).
4. Формирование EB
- Приготовьте стоковый раствор all-trans-RA при 10 мМ в ДМСО и распределите его по светозащищенным микропробиркам объемом 1,5 мл. Раствор стабилен при температуре -80 °C в течение двух недель. Бейте его от света.
- Трипсинизируйте ЭСК как показано на шаге 2.4; повторно вставьте свежий IMDM без LIF в качестве суспензии одиночных клеток.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и приготовьте суспензию 5 x 105 клеток/мл в IMDM с 0,5 мкМ РА.
- Тарелкой 100 капель по 20 мкл на 100 мм чашку Петри с 8-канальной пипеткой и наконечниками по 200 мкл переверните посуду и заполните перевернутую крышку PBS, чтобы предотвратить высыхание висячих капель. Защищайте RA-содержащие питательные среды от света.
- Посев БЭ в висячих каплях при 37 °С, 5%СО2, в течение 4 суток.
