1. Клонирование 2K7 Lentivector
- Перед клонированием интересующего гена в лентивирусный вектор 2K7 субклонируйте ген в вектор pENTR (3637.н., устойчивый к канамицину) с помощью стандартных молекулярных методов. Используйте сайты ограничения EcoRI и SacII для субклонирования.
- Усиление лентивектора 2K7
- Трансформируйте лентивекторную ДНК 2K7, аккуратно смешав 100 нг плазмидной ДНК с компетентными клетками, и инкубируйте на льду в течение 30 минут.
- ДНК теплового шока/компетентные клетки смешивают при 42 °C в течение 90 секунд и помещают их на пластины LB-агара, содержащие ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (15 мкг/мл) при 37 °C в течение 16-18 ч<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Хлорамфеникол используется для предотвращения рекомбинации между длинными концевыми повторами.
- На следующий день вырастите отобранные бактериальные клоны в среде Лурии-Бертани (LB), содержащей ампициллин (100 г/мл) и хлорамфеникол (15 мкг/мл) при 37 °C в течение 16-18 часов. Извлеките ДНК с помощью коммерческого набора плазмидной ДНК Maxiprep в соответствии с инструкциями производителя.
- Субклонирование из вектора pENTR в вектор 2K7 Lentivector (рис. 1).
- Добавьте в пробирку объемом 1,5 мл и аккуратно перемешайте: L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (промотор) (60 bng)1-2,5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (с интересующим геном) (80 bng)1-2,5 μl K7 lentivector (80 нг/μл)1 μл TE-буфера, pH 82-5 μl.Всего 8 μl.
- Удалите смесь ферментов клоназы с -80 °C и разморозьте на льду в течение 2 мин. Убедитесь, что этот фермент является свежей аликвотой при температуре -80 °C, так как фермент значительно снижает эффективность клонирования при повторных циклах замораживания-размораживания
- Добавьте 2 мкл фермента на каждую реакцию и хорошо перемешайте с помощью вихря и инкубируйте смесь для реакции клоназы при 23-25 °C в течение 6-24 часов.
- Добавьте 1 мкл раствора протеиназы К (поставляется с набором ферментов) в смесь для реакции клоназы и инкубируйте в течение 10 мин при 37 °C.
- Трансформируйте реакционную смесь клоназы в компетентные клетки и выращивайте выбранные колонии в LB-средах, содержащих ампициллин (100 мкг/мл) при 37 °C в течение 16-18 часов.
- Извлеките и очистите ДНК с помощью коммерческого набора Plasmid DNA Miniprep в соответствии с инструкциями производителя.
- Подтвердите наличие ДНК путем расщепления с помощью ферментов рестрикции Spe I и Sac II и соответствующего буфера в соответствии с инструкциями производителя для удаления фрагмента, содержащего интересующий промотор и ген.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для проверки того, имеет ли субклонированная ДНК правильный ген вставки, представляющий интерес, с правильным векторным каркасом. Размер самого вектора без вставленного фрагмента составляет 6.7 кб. Размер высвобожденного вставленного фрагмента включает в себя как промотор, так и ген вставки, представляющий интерес. Рассчитайте ожидаемые размеры фрагментов из дайджеста для конкретного гена с помощью программы редактирования последовательностей ДНК, например, APE-A Plasmid Editor.
- Проверьте размеры как скелета ДНК, так и высвобожденного фрагмента, запустив 1% агарозный гель в 1x TAE буфере (см. Таблицу 1) при 100 В.
- Амплифицируйте подтвержденную ДНК путем выращивания бактерий в 500 мл LB-среды, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) при 37 °C в течение 16-18 часов.
- Извлеките и очистите ДНК с помощью коммерческого набора плазмидной ДНК Maxiprep в соответствии с инструкциями производителя.
заметка: Maxiprep обычно генерирует достаточное количество ДНК, необходимое для производства вируса.
- Повторите шаги 1.3.9-1.3.10 для амплификации следующих ДНК для лентивирусных препаратов: Оболочечный вектор (PMD2. G, 6,1 kb), пакетный вектор (pBR8.91, 12,5 kb) и пустой лентивирусный вектор в качестве контроля (GFP-CMV-2K7, 8,7 kb).
2. Производство вируса 2K7
ПРИМЕЧАНИЕ: День 1:
- В день трансфекции поместите 32 миллиона HEK293 Т-клеток в колбу T175, содержащую 25 мл 293 Т-клеточных сред эмбриональной почки человека (HEK) (см. таблицу 1). В качестве альтернативы можно провести 16 миллионов клеток за день до трансфекции, если время в день трансфекции поджимает.
заметка: Трансфекция может быть столь же успешной при осаждении клеток в день трансфекции или до дня. При использовании любой из двух альтернатив критическим моментом здесь является убедиться, что клетки прилипли к поверхности чашки для культивирования до трансфекции.
заметка: День 2:
- Трансфекция
- Перед трансфекцией разбавьте ДНК до 1 г/л в буфере трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ТЕ), который содержит 10 мМ Трис pH 8, 1 мМ ЭДТА pH 8 в деионизированной воде.
- В пробирке объемом 50 мл приготовьте мастер-смесь (табл. 2) для трансфекции в колбу T175. Добавьте ДНК в предварительно нагретую модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) и хорошо перемешайте с помощью вихря, затем добавьте стерильный полиэтиленимин (PEI) (см. Таблицу 1, чтобы избежать преждевременного осаждения).
- Хорошо перемешайте, перевернув трубку в 3-4 раза, и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
- Выполните полную смену носителя на HEK293T ячейках. Полностью отасывайте питательные среды из клеток и скармливайте предварительно подогретыми HEK293T питательными средами для клеточных культур (25 мл на колбу T175).
- Добавьте трансфективную смесь (смесь ДНК/ПЭИ) по каплям к монослойным клеткам. Осторожно перемешайте и инкубируйте трансфицированные клетки при температуре 37 °C, 5% CO2, в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 3:
- Чтобы убедиться в успешности трансфекции, проверьте экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) через 24 часа после трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии.
заметка: Более 50% клеток, экспрессирующих GFP, обычно указывают на хорошую трансфекцию.
заметка: День 4:
- Через 48 часов после трансфекции соберите вирусную надосадочную жидкость и замените ее свежей средой HEK293 T (25 мл на колбу T175).
- Центрифугируйте вирусный надосадочный слой при давлении 1140 x g в течение 10 мин при 4 °C, чтобы очистить надосадочную жидкость от клеточного мусора. Переложите очищенную надосадочную жидкость в пробирку объемом 50 мл и храните при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 5:
- Через 72 часа после трансфекции соберите вторую партию вирусного надосадочной жидкости. Повторите шаг 2.3.1 и очистите надосадочную жидкость на 48 и 72 часа.
- Чтобы концентрировать вирус, центрифугируйте вирусную надосадочную жидкость при давлении 170 000 x g в течение 90 мин при 4 °C с использованием ультрацентрифужных пробирок объемом 30 мл.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторяйте шаг 2.6 до тех пор, пока вся очищенная надосадочная жидкость не будет центрифугирована, оставив (невидимую) гранулу вируса плюс осажденный PEI в основании пробирки.
- Чтобы ресуспендировать вирус, добавьте 500 мкл среды SATO (см. Таблицу 1) в ультрацентрифужные пробирки. Похлопайте в течение 30 секунд и соскребите основание трубки наконечником пипетки, чтобы механически ослабить вирус. Повторите этот шаг 6 раз, чтобы потерять вирусную гранулу.
- Объедините ресуспендированный вирус в микроцентрифужные пробирки и очень быстро вращайте, чтобы удалить нерастворимый PEI. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,45 мкм, чтобы удалить белки.
- Разложите вирус на 20 μл, 50 μл и 100 μл и храните при температуре -80 °C.
3. Преобразование OPC
- Посев первичных OPC в среду SATO (пластина 10 мл/10 см) с цилиарным нейротрофическим фактором (CNTF, 10 нг/мл), тромбоцитарным фактором роста (PDGF, 10 нг/мл), нейротрофином 3 (NT3, 1 нг/мл) и форсколином (4,2 мкг/мл) при 37 °C, 8%CO2 в течение 24 ч после диссекции.
- Полностью отсасывайте питательную среду OPC и кормите клетки свежеприготовленной средой SATO (10 мл) с факторами роста (см. выше в шаге 3.1).
- Добавьте вирус к OPC до оптимальной концентрации, культивируйте OPC в течение еще 48 часов.
4. Посев OPC для миелинизирующих кокультур (Рисунок 2)
- Чтобы удалить OPC с поверхности, сначала дважды промойте планшеты с OPC 8 мл сбалансированного раствора соли Эрла (EBSS), затем инкубируйте клетки с 5 мл теплого 0,05% Trypsin-EDTA, разведенного 1:10 с EBSS при 37 °C в течение 2 минут.
- Нейтрализовать трипсин с помощью 30% FBS в ЭБСС (5 мл) и удалить клетки из планшета с помощью пипетирования. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 180 x g в течение 15 минут при RT.
- Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл предварительно подогретой среды SATO с последующим подсчетом клеток.
- Перед посевом OPC полностью аспирируйте среду из культуральной пластины DRG. Осторожно засейте 200 000 OPC по каплям на нейроны DRG, как описано ранее.
заметка: Общий объем посева OPC должен быть менее 200 μл на 22 мм покровного стекла.
- Оставьте клетки осесть, не перемещая планшет, на 10 минут в шкафу для культуры тканей, затем аккуратно долейте 1 мл предварительно подогретой среды SATO на лунку.
- Замените оставшиеся сестринские OPC средой SATO с факторами роста (см. шаг 6.1). Используйте эти сестринские OPC для проверки экспрессии интересующего белка.
- Через 24 часа замените среду SATO на среду для совместной культуры (2 мл/лунка), содержащую среду SATO (без факторов) и нейробазальную (v/v) с 1% B2. Поддерживайте кокультуры в течение 14 дней со сменой среды каждые 2-3 дня.
- Оцените кокультуры на экспрессию миелинового белка с помощью вестерн-блоттинга и визуализируйте формирование миелинизированных аксональных сегментов путем двойного иммуноокрашивания антителами к маркерам основных белков миелина и нейрональным маркерам.
