$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Ручная сортировка флуоресцентно помеченных нейронов мыши
- Вытягивайте стеклянные микрокапилляры (см. Таблицу материалов) до выходного диаметра 10–15 мкм с помощью капиллярного пуллера со следующими настройками: тепло: 508, вытягивание: пустое, вел: пустое, время: пустое.
- Подсоедините гибкую силиконовую трубку 120–150 см (внутренний диаметр ~0,8 мм) к мембранному шприцевому фильтру длиной 0,2 мкм из поливинилидендифторида (PVDF) и двуходному клапану трубки с помощью подходящих трубочных соединителей.
- Приготовьте 500 мл охлажденной (4 °C) искусственной спинномозговой жидкости (ACSF, таблица 1) и насытьте кислородом, прокачивая 5% сбалансированный углекислый газ через воздушный камень в течение 15 минут или до полного исчезновения раствора.
- Приготовьте 100 мл ACSF с коктейлем блокаторов активности в стакане объемом 150 мл (Таблица 1).
- Приготовьте 100 мл ACSF с 1 мг/мл протеазы стрептококка IV в стакане объемом 150 мл (Таблица 1).
- Приготовьте 100 мл ACSF с 1% раствором фетальной бычьей сыворотки (FBS) в стакане объемом 150 мл и насытьте кислородом 5% сбалансированный кислород углекислого газа через воздушный камень.
- Препарируйте мозг усыпленной мыши, открыв черепную коробку маленькими ножницами и извлеките свежий мозг с помощью тонких щипцов><, не повреждая кору головного мозга.
заметка: Мышей любой породы, возраста и пола можно использовать по желанию. Не замораживайте мозг и не выполняйте ручную сортировку мышей, которым были введены вирусы или другие опасные/инфекционные агенты.
- Держите мозг в охлажденном и насыщенном кислородом ACSF, оставляя воздушный камень прикрепленным к кислороду баланса углекислого газа 5% в течение всего времени секции.
- Расположите мозг на вибратомном патроне и разрежьте корональные или сагиттальные срезы толщиной 300 мкм. Соберите столько секций, сколько нужно, чтобы получить минимум ~10–50 помеченных ячеек до нескольких сотен ячеек. Положите ломтики на держатель для ломтиков с хлопчатобумажной сеткой, поместите внутрь стакана, чтобы они были пропитаны кислородом ACSF.
- Переложите свежие ломтики в стакан, содержащий ACSF с блокаторами активности, и заблокируйте на 15–20 минут при комнатной температуре. Продолжайте пузыриться кислородом с помощью Airstone.
- Переместите ломтики в стакан, содержащий ACSF с раствором протеазы, чтобы выполнить мягкое разложение при комнатной температуре: 20–30 минут для животных P4-14 или до 45–60 минут для животных P28-56. Продолжайте пузыриться кислородом.
- Промойте ACSF с протеазой, переместив ломтики обратно в стакан, содержащий раствор блокаторов активности ACSF с блокаторами активности, в течение 5–10 минут при комнатной температуре. Продолжайте пузыриться кислородом.
- Переместите отдельные секции в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую ACSF с 1% FBS при комнатной температуре. С помощью флуоресцентной диссекции микрорассекают области и слои интереса, имеющие минимум 10–50 клеток (до нескольких сотен). Проведите микродиссекцию с помощью пары тонких щипцов или путем прикрепления инъекционных игл 22–28 G к деревянным держателям (шпажкам).
- С помощью пастеровской пипетки переместите микрорассеченные кусочки в микропробирку объемом 2 мл, содержащую ~0,8 мл 1% FBS в растворе ACSF.
- Растертую рассеченную ткань в микрофугальной пробирке при комнатной температуре. Изготовьте три пастеровские пипетки с длинным стержнем с уменьшающимся выходным диаметром, прокатав их над открытым огнем. Выполните ~10 взмахов каждой пипеткой, начиная с самой большой и заканчивая самой маленькой.
- Диссоциированные клетки диссоциированы в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую насыщенный кислородом ACSF (чашка Петри может быть тонко покрыта 5 мм 1% агаром или прозрачным силиконовым соединением в соотношении 1:10, если это необходимо). Хранить при комнатной температуре.
- Подождите ~5-7 минут, пока клетки постепенно осядут, затем наблюдайте за сигналом GFP/RFP под микроскопом для вскрытия.
заметка: Отдельные клетки, обломки и небольшие комки будут видны в светлом поле (BF).
- Выберите 10–15 ячеек GFP/RFP за раз с помощью капиллярной пипетки (из шага 1.1), прикрепленной к гибкой силиконовой трубке (внутренний диаметр 0,4–0,8 мм), и распределите ячейки в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую свежий насыщенный кислородом ACSF.
- Заблокировав конец клапана трубки язычком, расположите капилляр рядом с интересующей клеткой. Захватывайте клетки с помощью капиллярного воздействия после снятия блокировки и быстро заблокируйте снова, чтобы предотвратить попадание лишней жидкости в пипетку. Диспонируйте клетки на 100-миллиметровую чашку Петри со свежим кислородом ACSF, осторожно обдувая, наблюдая за кончиком капилляра под флуоресцентной оптикой диссекционного микроскопа. Стремитесь собрать ~100–150 ячеек.
- Повторите шаг 1.19 еще один или два раза (в зависимости от мусора) и перенесите в общей сложности ~50–75 ячеек в новую чашку Петри диаметром 100 мм, убедившись, что загрязняющие вещества, такие как мусор, минимальны в оптике дифференциального интерференционного контраста (DIC).
Таблица 1: Список решений и буферов.
| буфер | пункт | концентрация | Количество (μл) |
| Буфер сбора образцов | Рекомбинантный ингибитор рибонуклеазы | | 55 |
| ПКР | 1:50K разбавленный | 110 |
| Вода без нуклеаз | | 605 |
| Aliquot 43.75 μL из вышеуказанного в 16 пробирок (2 полоски по 8; 200 μL ПЦР-пробирки); добавьте следующее в каждую пробирку |
| UMI-праймеры (например, N10B1-N10B16) | 1 нг/мкл | 6,25 μл/туба |
| Конечный объем в каждой пробирке 50 μL (каждую пробирку можно разделить на 25 μL аликвот и заморозить при -80 °C) |
| Решения: | пункт | концентрация | количество |
| СМЖ: растворить 5 л | NaCl | 126 мМ | 36,8 г |
| KCl | 3 мМ | 1,15 г |
| 2PO4 | 1,25 мМ | 0,75 г |
| НаОГС3 | 20 мМ | 8,4 г |
| До 500 мл ACSF пузырчатый кислород в течение 10-15 минут, затем каждый раз добавляйте следующее: |
| D-глюкоза | 20 мМ | 1,8 г |
| MgSO4 | 2 мМ | 0,5 мл со склада 4 М |
| CaCl2 | 2 мМ | 0,5 мл со склада 4 М |
| Поддерживайте насыщение кислородом ACSF на протяжении всего времени |
| Решения: | пункт | Концентрация |
| Коктейль для блокировки активности: сделайте 100-кратный бульон |
| К 100 мл ACSF добавьте | | |
| БПА | 0,05 мМ | |
| CNQX | 0,02 мМ | |
| ТТХ | 0.0001 мМ (0.1 μМ) |
| Решения: | пункт | количество | |
| Раствор протеазы (100 мл) | Протеаза из Streptomyces griseus | 100 мг | |
| Фетальная бычья сыворотка: коммерческий источник, аликвота в 500 мкл для каждого использования. |