$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Сбор и культивирование клеток линии OL (OL)
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги следует выполнять в колпаке с ламинарным потоком в стерильных условиях.
- На следующий день после встряхивания приготовьте среду Боттенштейна-Сато (BS) в соответствии с таблицей 1.
- Покрытые покрытием чашки Петри ополосните 3 раза стерильной дистиллированной водой.
- Соберите надосадочную жидкость из колб, содержащую в основном клетки линии ОЛ, а также некоторые клетки микроглии, и поместите ее на чашки Петри диаметром 100 мм без покрытия.
заметка: Этот этап позволяет удалить клетки микроглии за счет дифференциальной быстрой адгезии к поверхности чашки.
- Инкубируйте чашки Петри в течение 15 минут в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C при 5%CO2.
- Наполните каждую колбу T150 25 мл теплой, свежеприготовленной питательной среды и инкубируйте в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C при 5%CO2 до второго встряхивания.
- Перенесите надосадочную жидкость из чашек Петри в новые 100-миллиметровые чашки Петри без покрытия, чтобы обеспечить адгезию остаточных клеток микроглии.
- Инкубируйте чашки Петри в течение 15 минут в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C при 5%CO2.
- Удалите надосадочную жидкость, которая содержит неадгезивные клетки линии ОЛ, и перенесите ее в пробирки объемом 50 мл (надосадочная жидкость из 2 чашек Петри на пробирку объемом 50 мл). Откажитесь от чашек Петри, покрытых микроглией.
- Центрифугируйте надосадочную жидкость в течение 5 мин при 423 x g. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу 1 мл BS-среды. Объедините все гранулы в общую пробирку объемом 50 мл и отрегулируйте объем до 10 мл с помощью среды BS.
- Определение плотности клеток путем подсчета клеток под микроскопом.
заметка: Плотность клеток должна быть получена в диапазоне от 3 x 105 клеток/мл до 5 x 105 клеток/мл.
- Добавьте 20 мл BS, если плотность клеток выше или равна 4 x 105 клеток/мл, чтобы получить конечный объем 30 мл, или добавьте только 10 мл BS, если плотность клеток меньше 4 x 105 клеток/мл, чтобы получить окончательный объем 20 мл.
- Планшет два или три предварительно покрытых 100 мм чашки Петри 10 мл клеточной суспензии. Инкубировать в увлажненном инкубаторе при 37 °C при 5%CO2.
- Очистите чашки Петри от мусора, освежив всю среду BS через 2 часа.
заметка: Исследуйте культуру под микроскопом до и после очистки, чтобы убедиться в плотности клеток и эффективности удаления мусора.
- Инкубировать в течение 2 суток в среде BS во увлажненном инкубаторе при 37 °C при 5% CO2,
заметка: Рассмотрите культуру под микроскопом. Слияние должно составлять от 70% до 80%.
2. Производство OCM
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги в колпаке с ламинарным потоком в стерильных условиях.
- Приготовьте среду NB-B27low согласно таблице 2.
- Обновите питательную среду 10 мл теплой среды NB-B27lowlow. Инкубировать в течение 2 суток в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C при 5%СО2.
- Соберите ОКМ, т.е. надосадочную жидкость, содержащую ОЛ-секретируемые факторы. Фильтр-стерилизация OCM с помощью фильтра 0,22 мкм.
заметка: Хранить OCM при температуре 4 °C не более 2 месяцев.
Таблица 1: Приготовление среды Боттенштейна-Сато (BS).
| Боттенштейн-Сато (BS) медиа | Конечная концентрация |
| Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco | |
| Пенициллин-стрептомицин | 100 МЕ/мл |
| apo-Transferrin human | 100 мкг/мл |
| BSA (Бычья сыворотка альбумина) | 100 мкг/мл |
| инсулин | 5 мкг/мл |
| ФГВФЛ | 10 нг/мл |
| Прогестерона | 62 нг/мл |
| Путресцина дигидрохлорид | 16 мкг/мл |
| Селенит натрия | 40 нг/мл |
| Т3 (3,3',5-трийодо-L-тирониновая натриевая соль) | 30 нг/мл |
| T4 (L-тироксин) | 40 нг/мл |
Таблица 2: Приготовление сред NB-B27low и NB-B27.
| NB-B27 с низким уровнем среды | Конечная концентрация |
| Нейробазальный | |
| Доплата B27 | В 0,5 раза |
| L-глютамин | 0,5 мМ |
| Пенициллин-стрептомицин | 100 МЕ/мл |
| Носители NB-B27 | Конечная концентрация |
| Нейробазальный | |
| Доплата B27 | 1x |
| L-глютамин | 0,5 мМ |
| Пенициллин-стрептомицин | 100 МЕ/мл |