- Компартментная культура ганглиев дорсальных корешков крыс (DRG), олигодендроцитов (OPC) и hGC (клеток глиомы человека)
1. Приготовление блюд из разделенных культур
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги за несколько дней до запланированного сбора урожая DRG.
- Соберите блюда для культуры в отсеках.
- Развести исходный раствор коллагена до 500 мкг/мл в стерильном дистиллированном Н2О; тщательно перемешать.
- С помощью стерильной переводной пипетки заполните чашку для культуры диаметром 35 мм 2 мл раствора коллагена; удалите раствор, оставив тонкую коллагеновую пленку, и поместите его в следующую чашку диаметром 35 мм. Повторяйте этот процесс, добавляя больше коллагенового раствора по мере необходимости, пока вся посуда не будет покрыта.
- После того, как все пластины будут покрыты, поместите пластины в лоток для культур размером 245 мм x 245 мм и положите три марлевые салфетки размером 1 мм x 1 мм в центр лотка.
- Для полимеризации коллагена смочите марлевые салфетки 1 мл концентрированного гидроксида аммония и накройте лотки на 15 мин.
- Снимите марлевые салфетки и дайте посуде диаметром 35 мм высохнуть в колпаке с ламинарным потоком.
- Пока посуда сохнет, загрузите цилиндр аппликатора смазки шприца высоковакуумной смазкой. Поместите камеры с отсеками в большую горлышковую бутылку для фильтрующего материала, наполненную дистиллированной водой. Простерилизовать как автоклавированием, так и дать остыть.
- Подпилите кончик иглы 18-G, чтобы получился тупой кончик. Стерилизовать в 70% этаноле. Приложите иглу к шприцу со смазкой.
- Простерилизуйте грабли для штифтов, замочив их в 70% этаноле; дайте им высохнуть на воздухе в колпаке с ламинарным потоком.
- Снимите крышку с сухой, покрытой коллагеном посуды диаметром 35 мм. Держите тарелку между большим и указательным пальцами. Другой рукой держите грабли для кегли. Сильно надавите, чтобы создать ровные царапины шириной 200 μМ по всему центру чашки.
- С помощью пастбищной пипетки поместите две капли Supplemented Neuronal Basal Medium в центр царапин.
- Повторяйте шаги 1.1.10-1.1.11 до тех пор, пока вся посуда не будет поцарапана.
- Высушите отсеки камер в ламинарном проточном колпаке.
- Стерильными гемостатическими щипцами возьмитесь за одну камеру с отсеками за центральную перегородку. Переверните кровоостанавливающие щипцы так, чтобы дно камеры было обращено вверх.
- Нанесите силиконовую смазку на камеру с отсеками, начиная сверху. Следите за тем, чтобы смазка была размещена аккуратно и перекрывалась во всех углах.
- Снимите крышку с посуды диаметром 35 мм. Переверните чашку и поместите царапины на камеру. Легкими похлопывающими движениями по нижней части пластины с помощью щипцов.
- Аккуратно переверните пластину с помощью кровоостанавливающих щипцов. Отпустите щипцы.
- Поместите холмик смазки в основание центрального отсека. Заполните каждую камеру дополненной нейрональной базальной средой (NB) и проверьте на наличие утечек. При необходимости закройте протечки силиконовой смазкой.
- Продолжайте собирать все формы для культур и храните в течение ночи при температуре 37°C, 5%CO2.
