Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление растворов и материалов
- Приготовьте раствор Рингера, смешав 123,3 мМ NaCl, 1,53 мМ CaCl2, 4,96 мМ KCl, 0,809 мМ Na2HPO4 и 0,147 мМ KH2PO4 (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте pH до 7,4 и стерилизуйте фильтром в бутылки объемом 100 мл. Хранить в чистом, сухом месте. Не мойте бутылки с мылом (обрабатывайте стеклянную посуду как тканевые культуры).
- Приготовьте 1 мг/мл исходного раствора фибронектина (ФН) (см. Таблицу материалов) путем растворения ФН в стерильном растворе Рингера и храните в 100 мкл аликвот при -80 °С (стабильно не менее 4 лет).
- Готовьте полноценные питательные среды, добавляя в среду L15 0,8% L-глутамина, 0,08% пенициллина/стрептомицина, 10% FBS и 10% экстракта куриного эмбриона. Создать 3 мл аликвот и хранить при температуре -20 °C или -80 °C.
заметка: Если культуры инкубируются в инкубаторе сCO2, модифицированную среду Eagle F12 (DMEM/F12) от Dulbecco необходимо заменить L15, который буферизуется для воздуха.
- Подготовьте опорные рамки из фильтровальной бумаги (прямоугольники из бумаги размером примерно 1 см х 1,5 см с двумя или тремя перфорированными отверстиями, перекрывающимися по длинной оси).
- Пробейте отверстия по краю большого листа фильтровальной бумаги с помощью стандартного дырокола с тремя отверстиями, обрежьте пробитый край в полоску, а затем разрежьте полоску между отверстиями на прямоугольники ~ 1,5 см в длину. Автоклавная фильтровальная бумага перед использованием (опционально).
- Соберите инструменты для препарирования, в том числе тонкие щипцы (#1), тупые щипцы, ножницы для рассечения, пружинные ножницы и заточенные вольфрамовые иглы.
2. Приготовление блюд из культуры
- Выберите чашки для культуры нейронной складки (см. Таблицу материалов), подходящие для последующего применения.
- Для культур, которые будут закреплены и окрашены, используйте стеклянные покровные стекла, помещенные в многолуночные чашки для культивирования тканей.
заметка: Покровные стекла, соответствующие размеру лунки, будут меньше перемещаться при смешивании жидкости, что снижает вероятность смещения эксплантов и с большей вероятностью прилипает к покровному стеклу, а не к дну чашки.
- Выберите однокамерные или разделенные чашки со стеклянным дном (см. Таблицу материалов) для получения изображений в реальном времени с помощью инвертированного микроскопа.
- Для получения изображений в реальном времени на вертикальном или стереомикроскопе используйте 6-, 12- или 24-луночные оптически подходящие тканевые планшеты.
- Выберите пластиковые чашки для культивирования тканей для массового сбора мигрирующих клеток нервного гребня для высокопроизводительного анализа.
- Добавьте 10 ЕД/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина в 100 мл флакона стерильного раствора Рингера (например, 100 мкл 10 000 ЕД/мл пенициллина и 10 000 мкг/мл стрептомицина, чтобы получить P/S Рингера). Используйте Ringer's P/S в течение 1 недели.
- Разморозьте аликвоту 1 мг/мл FN на льду. Разбавляют с помощью P/S Рингера до концентрации 10-100 мкг/мл FN.
- Пипеткой достаточно раствора ФН, чтобы покрыть дно лунки или посуды. Например, 100 мкл на лунку в 24-луночном планшете, 500 мкл на 35-миллиметровом планшете.
- Замените крышку и инкубируйте чашки или тарелки с раствором FN во влажном инкубаторе (или на закрытом лотке с дистиллированными бумажными полотенцами, пропитанными водой) при температуре 38 °C (100 °F) в течение не менее 1 часа, рассекая нервные складки.
3. Рассечение нейронных складок
- Переложите эмбрион в чистую посуду с раствором Рингера P/S и промойте эмбрион, держа рамку фильтровальной бумаги щипцами и осторожно помахивая взад и вперед, чтобы удалить любой желток, который закрывает обзор эмбриона. Обменяйте P/S Ringer или переложите на свежее блюдо, если стало мутно.
- Расположите эмбрион тыловой/рамочной стороной вверх под препарирующим микроскопом. Оставив эмбрион на бумажной рамке, чтобы он оставался натянутым и удерживался на месте, удалите вителлиновую мембрану с помощью щипцов, чтобы обнажить нервные складки><.
заметка: Если эмбрион отваливается от бумажной рамки, его можно разложить в чашке или приколоть к помещице, покрытой силгардом, для вскрытия.
- С помощью пружинных ножниц или заточенной вольфрамовой иглы аккуратно иссеките нервные складки среднего мозга. Включите тканевый каудально к расширяющимся зрительным пузырькам и ростральный к заднему мозгу, где ромбомерные сужения только начинают проявляться (сердечный полумесяц также является полезным индикатором, рис. 1B, C). Позаботьтесь об удалении самого дорсального аспекта нервной складки с минимальным загрязнением нервной трубки и ненервной эктодермы (Рисунок 1C).
- Перенесите нервные складки в чистую чашку, содержащую P/S Ringer's с помощью пипетки P20 или стерильной стеклянной пипетки Пастера, промытой желтковым P/S Ringer's (это блокирует пластик или стекло, предотвращая прилипание ткани). Собранные складки храните на льду, одновременно рассекая дополнительные складки.
4. Покрытие нейронных складок
- Разморозьте аликвоту полной питательной среды (раздел 1, шаг 3). Добавьте 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина и простерилизуйте фильтром. Поддерживайте подготовленную среду при температуре 37-38 °C во время выполнения других действий.
- Выньте из инкубатора тарелки для культивирования (раздел 2, шаг 5). С помощью пипетки или пастеровской пипетки удалите раствор FN с покровных стекол, посуды или лунок. После промывки субстрата, покрытого FN, с помощью P/S Рингера, добавьте соответствующий объем полной питательной среды в чашки или лунки (500 мкл для лунок в 24-луночном планшете, 2 мл для 35-миллиметрового планшета или шестилуночного планшета).
заметка: Меньшие объемы позволяют сохранить дорогостоящие реагенты (например, всего 200 мкл для 24-луночного планшета), но при этом обеспечить достаточную влажность чашки во избежание испарения.
- С помощью пипетки p20 или p200 сначала промойте наконечник пипетки желтковым P/S Ringer's P/S, чтобы заблокировать пластик и предотвратить прилипание ткани. Затем перенесите изолированные нервные складки на покровные стекла с покрытием FN, стараясь передать как можно меньше P/S Ringer. Поместите фальцы по направлению к центру покровного стекла с покрытием FN.
заметка: На покровном листе 12 мм в колодце 19 мм может быть нанесен один или несколько нервных складок, на пластине 35 мм – до 50 .
- Дав эксплантам отстояться в течение 10-15 минут, поместите их во увлажненную камеру при температуре 38 °C (100 °F), медленно и осторожно перенося чашки для культуры с пластинчатыми нервными складками. Это сведет к минимуму смещение нервных складок в скважинах, гарантируя, что они останутся диспергированными и прилипнут к любым покровным стеклам.
заметка: При использовании L15 (не DMEM) чашки для эксплант-культур также можно инкубировать в инкубаторе для яиц, используя закрытый лоток с увлажненными бумажными полотенцами.
- Инкубируйте культуры нервных складок в увлажненном инкубаторе в течение всего периода активной миграции (всего около 16-20 часов, рис. 2).
