Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Решения и инструменты, описанные в этом разделе, могут быть сделаны задолго до времени и использованы в день вскрытия и записи.
- Приготовьте среду Либовица с добавлением 10 мМ HEPES (раствор L-15). Следующие шаги описывают приготовление 1 л раствора L-15.
- Налейте 990 мл деионизированного H2O в одну мензурку. Отмерьте и добавьте 2,386 г (10 мМ) HEPES. Добавьте в одну бутылку 1 л порошка раствора L-15.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Порошкообразный L-15 имеет более длительный срок хранения и занимает меньше места при хранении. В качестве альтернативы можно приобрести раствор L-15 и дополнить препаратом HEPES. Последний вариант также предусматривает использование раствора, не содержащего фенола, что полезно для флуоресцентной визуализации.
- Размешайте раствор на тарелке для перемешивания. С помощью рН-метра медленно добавьте 1 Н гидроксида натрия (NaOH), чтобы получить pH от 7,34 до 7,36.
- Добавляйте деионизированный H2O до тех пор, пока раствор не достигнет объема 1000 мл. Отфильтруйте раствор с помощью мембраны размером пор 0,22 мкм.
заметка: Раствор L-15 можно хранить при температуре 4 °C в течение 1-2 недель. При использовании L-15, содержащего фенол-красный, раствор станет розовым, если он слишком основной (pH > 7,4), или оранжевым, если слишком кислым (pH < 7,34).
- Подготовьте питательную среду для вестибулярных ганглиозных нейронов (ВГН). Выполните следующие действия, чтобы приготовить 50 мл питательной среды:
- Добавьте 47,5 мл минимально необходимой среды GluMAX-I в чистую стеклянную мензурку.
- Отмерьте и добавьте 0,1194 г (10 мМ) HEPES. Этот дополнительный буфер устойчив к изменениям pH, пока клетки оседают перед перемещением в инкубатор.
- Добавьте 2,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS). Это составляет 5% по объему FBS при общем объеме 50 мл среды.
- Размешайте раствор на тарелке для перемешивания. Используя pH-метр, медленно добавьте 1 N NaOH, чтобы получить pH от 7,38 до 7,4.
- Добавьте 0,5 мл пенициллин-стрептомицина. Отфильтруйте раствор через стерильный фильтр 0,22 мкм. Хранить раствор при температуре 4 °C.
- Не менее чем за 30 минут до использования переложите питательную среду в колбу для культуры тканей с вентилируемым колпачком. Поместите колбу с питательными средами в инкубатор с концентрациейСО2 5% при температуре 37 °С.
2. Изготовление пипеток для растирания
ПРИМЕЧАНИЕ: Тритурационные пипетки можно повторно использовать для нескольких экспериментов. Промойте пипетки этанолом, водой и раствором L-15 перед каждым использованием и очищайте их водой и этанолом после каждого использования. Бережно хранить между использованиями.
- Чтобы подготовить пипетки для растирания клеток, поднесите стеклянную пипетку Пастера к пламени горелки Бунзена. Как только стеклянный наконечник начнет плавиться, растяните стекло до нужного диаметра наконечника. Потяните один конец пипетки в сторону от пламени, чтобы создать небольшой изгиб.
- Поднесите согнутую пипетку к микроскопу. С помощью надрезной плитки надрежьте и разбейте стекло нужного диаметра.
- Проведите кончиком пипетки над верхней частью пламени горелки Бунзена. Это позволит быстро отполировать шероховатые края возле кончика. Убедитесь, что наконечник не запечатан пламенем.
- Повторяйте процесс до тех пор, пока не будут подготовлены четыре или пять пипеток разного размера.
3. Извлечение вестибулярного ганглия и покрытие вестибулярных нейронов
- Подготовка к вскрытию
- Приготовьте ферментную смесь из раствора L-15 с 0,05% коллагеназы и 0,25% трипсина. Например, добавьте в стакан 0,001 г коллагеназы и 0,005 г трипсина к 2 мл раствора L-15, добавьте небольшую магнитную мешалку и перемешайте до полного перемешивания. Отставьте в сторону при комнатной температуре.
- Приготовьте коммерчески приобретенную гильотину, положив бумажные полотенца сбоку и под гильотину, чтобы свести к минимуму воздействие крови и других биологических материалов на столешницу и другие поверхности.
- Разложите большие ножницы из нержавеющей стали, большие щипцы и большие пружинные ножницы. Держите под рукой большой пульверизатор с 70% этанолом для чистки головы.
- Наполните стакан объемом 100 мл раствором L-15 и положите его на лед. Насытьте кислородом раствор L-15.
- Разложите пружинные ножницы, хирургические ножницы, щипцы, скальпель и переводную пипетку (см. Таблицу материалов).
- Подготовьте чашку Петри диаметром 60 мм (для грубого вскрытия) и две чашки Петри диаметром 35 мм (для очистки/тонкого рассечения ганглий). Наполните чашку диаметром 60 мм насыщенным кислородом раствором L-15 с помощью шприца объемом 30 мл с фильтрующим наконечником 0,22 мкм.
- Эвтаназия, чистка головы и гемисекция
- Взвесьте щенков, чтобы рассчитать подходящую дозу разведения fatal-plus для внутрибрюшинного введения (~0,01 мл на 10 г).
- Как только будет достигнута глубокая плоскость анестезии, что оценивается по отсутствию реакции на защемление пальца ноги, обезглавить с помощью гильотины.
- Тщательно промойте голову 70% этанолом, а затем тщательно раствором L-15.
- Полностью снимите кожу с черепа. Рассеките голову пополам с помощью больших пружинных ножниц, начиная с точки входа спинного мозга в головной мозг и делая два надреза, первый из которых проходит через верхнюю часть черепа, а второй — через нижнюю часть челюсти. Завершите рассечение головы пополам с помощью хирургических ножниц.
- Поместите обе половины головы мозгом вниз в чашку Петри диаметром 60 мм, заполненную раствором L-15. Положите свежую ткань, которая в данный момент не рассекается, на лед.
- Удаление верхнего вестибулярного ганглия
- Вычерпайте мозг с помощью закрытых хирургических ножниц. Отрежьте и удалите черепной нерв, чтобы полностью отделить мозг от черепа.
заметка: На этом этапе глазная капсула (по форме напоминающая цифру 8) должна быть видна на затылке.
- С помощью щипцов, начиная с затылка, снимите прозрачный пленчатый материал.
- Вырежьте верхнюю часть черепа с помощью хирургических ножниц. Удалите излишки ткани с затылка и шеи, чтобы сделать область рассечения и глазную капсулу чище и более легкодоступными.
заметка: Избегайте слишком мутного посуды, отбрасывая лишнюю ткань на протяжении всей процедуры.
- Переложите ткань во вторую чашку Петри со свежим раствором L-15. Найдите глазную капсулу и слуховой, верхний вестибулярный и нижний вестибулярные нервы. Отрежьте слуховой нерв и отделите верхнюю и нижнюю ганглии с помощью маленьких пружинных ножниц.
заметка: Хотя соматы вестибулярного нерва находятся как в нижних (более тонких), так и в верхних (более толстых) ганглиях, клетки, извлеченные из верхнего ганглия, имеют лучшую выживаемость.
- С помощью скальпеля аккуратно сбрейте костный гребень, чтобы ослабить костную область, под которой нерв погружается в костную капсулу. Аккуратно удалите мусор тонкими щипцами, обнажив всю опухшую часть ганглия.
- Используйте тонкие пружинные ножницы, чтобы разрезать и отделить ганглий от ветви периферического нерва, которая ныряет к утрикулу.
- Удалите верхний ганглий с помощью тонких щипцов, стараясь не зажимать слишком близко к ганглионарной ткани. Переложите в чашку Петри 35 мм со свежим раствором L-15.
- Прежде чем продолжить, предварительно подогрейте ферментный раствор: вылейте ферментную смесь в чашку Петри диаметром 35 мм и поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 10-15 минут.
- Очистите ганглий с помощью тонких щипцов и маленьких пружинных ножниц, удалив кость (которая выглядит белой и кристаллизованной по структуре), лишнюю ткань, нервные волокна и любые другие лишние структуры. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму удаление любой ганглионарной ткани.
- Диссоциация тканей и нанесение покрытий
- Переложите очищенные ганглии в предварительно подогретый ферментный раствор и поместите его обратно в инкубатор на 10-40 минут. Лечение ферментами завершено, как только ткань начинает разрушаться, но остается целой. Чрезмерная обработка ткани ферментами приведет к полному растворению ганглиев до растирания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество времени, в течение которого ткань подвергается ферментативной обработке, зависит от возраста животного. Например, ганглии крыс Р9 обрабатывают ферментом в течение 25 мин, а ганглии крыс Р15 обрабатывают ферментом в течение 35 мин.
- Переложите ганглии в чашку Петри 35 мм со свежим раствором L-15 и выдерживайте 2-3 минуты.
- Переложите ганглии в другую чашку Петри толщиной 35 мм, заполненную отфильтрованной питательной средой.
- С помощью микропипетки объемом 200 мкл нанесите каплю ~150 мкл отфильтрованной питательной среды на чашку со стеклянным дном с покрытием. Не добавляйте слишком много раствора, так как важно поддерживать поверхностное натяжение, чтобы образовался пузырь раствора, который остается над стеклянным покровным стеклом.
- Перенесите нужное количество ганглиев (от одного до четырех) на покровный лист.
- Наберите небольшое количество питательной среды из чашки для культивирования, чтобы промыть пипетку для растирания средой, чтобы предотвратить прилипание ткани к стенкам стеклянной пипетки. Растирайте путем осторожного и многократного пропускания ткани через пипетку до тех пор, пока ганглии не будут достаточно диссоциированы.
заметка: Не переусердствуйте с тканью, чтобы попытаться взвесить одиночные клетки, и не позволяйте клеткам упасть на дно чашки при чрезмерном положительном давлении. Также избегайте образования пузырьков воздуха, так как это снизит выживаемость клеток. Мягкая растирание является ключом к достижению успешной выживаемости клеток.
- Дайте клеткам отдохнуть 5 мин. Проверьте под световым микроскопом, не осели ли клетки на покровном стекле.
- Осторожно поместите чашку для культивирования в инкубатор с температурой 37 °C на 12-24 часа. Опять же, убедитесь, что пузырь раствора не поврежден.
заметка: При культивировании в течение более 24 часов ежедневно обновляйте питательную среду. Это может быть возможной точкой паузы.
