$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Диссоциация тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие процедуры проводятся в шкафу биобезопасности для стерильных культур тканей с использованием асептической техники и стерильных материалов.
- Добавьте 1 мл 0,05% трипсина, содержащего 0,53 мМ ЭДТА, в каждую 15 мл конической пробирки 9 мл DMEM и ткани, чтобы начать лизис тканей><.
заметка: DMEM содержит большое количество хлорида кальция, который может действовать как ингибитор трипсина. Если диссоциация не завершена в соответствии с описанными шагами, можно использовать сбалансированный раствор соли Хэнкса без кальция или магния. После трипсинизации фермент может быть нейтрализован добавлением ингибитора трипсина, хотя кальций следует добавить обратно в раствор, поскольку он является кофактором для ДНКазы I, которая используется на последующих этапах.
- Растирать с помощью пипетки объемом 10 мл примерно в 20 раз.
- Перенесите клеточные суспензии в пустые конические пробирки объемом 50 мл.
- Инкубировать раствор при 37 °C, 5%CO2 в течение 15 минут, осторожно перемешивая лизаты через 8 минут.
- Добавьте 5 мл MGM и 200 мкл (5 мг/мл) ДНКазы I в каждую пробирку до конечной концентрации 50 мкг/мл.
- Измельчите каждый лизат с помощью пипетки объемом 10 мл 10 раз.
- Дайте клеточной суспензии постоять в течение 3 минут при комнатной температуре, чтобы недиссоциированная ткань осядла на дне трубок.
- Перенесите клеточные суспензии в новые конические пробирки объемом 50 мл, оставив позади недиссоциированную ткань.
заметка: Описанные выше этапы лизиса и растирания значительно ограничивают количество недиссоциированной ткани.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 300 x g в течение 3 минут при 4 °C без тормоза.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте оставшиеся клеточные гранулы в 5 мл MGM.
- Измельчите гранулу с помощью пипетки объемом 5 мл 20 раз.
- Поместите 5 мл клеточных суспензий в колбы с покрытием T25.
- Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%CO2 и сначала смените среду через 24 ч для удаления клеточного мусора.
заметка: Некоторые протоколы рекомендуют первоначальную смену среды через 72 часа. Может потребоваться оптимизация этого шага.
- Проводите 100% смену среды с помощью MGM каждые 48-72 ч до тех пор, пока клетки не слились на 80% (примерно 5-7 дней).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сменой среды все среды должны быть нагреты до 37 °C.
2. Выделение клеток-предшественников олигодендроцитов
При нанесении покрытия на OPC после первоначальной изоляции, они должны быть нанесены на поверхность, покрытую поли-D-лизином (стерильная пластина или покровное стекло). Подготовьте эти материалы перед тем, как закончить работу над этим разделом.
- После 15-часового встряхивания извлечь надосадочную жидкость из колб и тарелки на стерильную чашку Петри диаметром 100 мм.
- Инкубируйте надосадочную жидкость при температуре 37 °C, 5%CO2 в течение 30 минут, а через 15 минут взбалтывайте, чтобы удалить остатки микроглии, так как они очень быстро прилипнут к чашке. Для этого этапа можно использовать чашки Петри, не обработанные тканевыми культурами.
- Удалите неадгезивную клеточную надосадочную жидкость, подсчет и планшет на поверхности, покрытой поли-D-лизином. Как правило, гальванизируется 7 500-10 000 OPC/см2.
- Инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение не менее 1 ч (до 6 ч), затем осторожно отсасывайте 95% среды и медленно добавляйте теплую среду OPC, пипетируя среду у стенки лунки, чтобы свести к минимуму разрушение OPC. Меняйте среду каждые 48 часов, пока элементы не будут готовы к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы за один раз менялась только одна скважина. OPC чувствительны и особенно непереносимы к сухим условиям. Добавление PDGF-AA в среду OPC приводит к задержке созревания OPC в олигодендроциты. Этот фактор может быть исключен из питательных сред, если в центре внимания эксперимента находятся зрелые олигодендроциты.
Таблица 1: Буферные и медиа-рецепты.
Mixed Glia Media (MGM)
| 88 мл | 1X DMEM (с высоким содержанием глюкозы, с L-глутамином, с пируватом) |
| 10 мл | Термоинактивированный FBS |
| 1,0 мл | L-глютамин (100X) |
| 1,0 мл | Антибиотик/антимикотик |
OPC Media (50mL)
| 49 мл | Нейробазальные медиа |
| 1,0 мл | Доплата B27 (50X) |
| 10 нг/мл | ПДГФ-АА |
| ПРИМЕЧАНИЕ: PDGF-AA добавляется свежим перед каждой сменой носителя. |