Метод получения органоидов мозга из эмбриональных стволовых клеток человека

Аннотация

Источник: Boisvert, E. M., et al. Статический самоуправляемый метод генерации органоидов мозга из эмбриональных стволовых клеток человека. J. Vis. Exp (2020).

Это видео демонстрирует технику создания церебральных органоидов из человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESCs). Адгезивную культуру колоний hESC обрабатывают ферментами, чтобы отделить и разбить их на кластеры. Эти кластеры образуют трехмерные сферы в суспензии, которые затем дифференцируются в органоиды, имитирующие кору головного мозга со слоями нейронов и глиальных клеток.

Протокол

1. Поддержание стволовых клеток

1. Поддерживайте H9 hESCs на слое матрицы базальной мембраны с уменьшенным фактором роста (см. Таблицу материалов, далее просто матрицу) в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Чтобы покрыть одну 6-луночную пластину или одну чашку 10 см, смешайте 100 мкл матрицы с 5,9 мл ледяной модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM)/F12. Оберните пластины парафиновой пленкой и храните в течение ночи при температуре 4 °C. Используйте их на следующий день для пропускания клеток после того, как избыток матрицы/среды будет аспирирован.
2. Культивируйте клетки из недели в неделю в соотношении примерно 1:12 каждые 7 дней. Поддерживайте клетки с помощью среды mTESR-1 в инкубаторе с низким содержанием кислорода при температуре 37 °C (5%_O2, 5%_CO2). Обновляйте медиафайлы ежедневно. Отсеивают дифференцирующие клетки из культуры между ходами с помощью стеклянных инструментов.
3. Клетки H9 должны быть пропущены за четыре-шесть дней до использования их для производства органоидов. Клетки должны проходить в соотношении кластеров клеток примерно 1:8. Для этого начните с промывки клеток модифицированной средой F-12 (DMEM/F12) от Dulbecco и диссоциируйте клетки нейтральной протеазой (например, диспаза, далее именуемая просто протеаза), промойте DMEM/F-12 и рассыпьте 30-60 клеточных кластеров на 4 планшетах (6 лунок или 10 см) при конфлюенции ~20%. За два дня до сбора урожая переведите их в обычный инкубатор (21%_О2, 5%_СО2). Пластины должны достигать ~80% слияния при начале формирования органоидов.

2. Диссоциация hESCs для органоидной культуры

1. Аликвот исходного раствора протеазы (5 Ед/мл).<бр/> заметка: Обычно мы замораживаем 1 мл аликвот при -20 °C для использования в течение нескольких месяцев.
2. Разбавьте стоковый раствор протеазы до рабочей концентрации, добавив 1 мл стокового раствора плюс 5 мл DMEM/F12 на каждую 6-луночную или 10-сантиметровую пластину hESCs.
3. Аспирируйте и удалите среды клеточных культур, затем покройте hESCs раствором протеазы. Поместите планшеты в инкубатор на 10-15 мин или до тех пор, пока края колоний не округлятся вверх и не начнут отделяться от матрицы.
4. Наклоните пластину, отсадите раствор протеазы и аккуратно промойте клетки DMEM/F12 три раза. Используйте 2 мл / лунку для каждой промывки при использовании 6-луночного планшета и 6 мл при использовании 10-сантиметровой пластины. Убедитесь, что колонии остаются прикрепленными к матрице при выполнении этого шага.
5. Добавьте обратно около 1,5 мл свежей среды mTESR в каждую лунку (или 5 мл для 10-сантиметровой пластины) и промойте клетки с планшета с помощью щадящего пипетирования.
6. С помощью пипетки объемом 10 мл осторожно отасуньте и распределите hESC внутри планшета, пока они не достигнут примерно 1/30 своего первоначального размера. По завершении этих этапов скопления колоний должны напоминать квадраты размером ~250-350 мкм.

3. Генерация органоидов

1. Перенесите клетки в одну колбу T75 со сверхнизким уровнем прикрепления, содержащую 30 мл среды mTESR без основного фактора роста фибробластов (bFGF).
2. На следующий день наклоните колбу (колбы) так, чтобы живые клетки оказались в углу (в первый день это может занять 5-10 минут, но по мере увеличения скоплений будет становиться быстрее).
   заметка: Если на этом или на любых последующих этапах на дне колбы прилипло большое количество ячеек, перенесите ячейки в новую колбу. Нормально иметь высокую популяцию мертвых клеток в течение первых двух дней. При смене среды обязательно удаляйте как можно больше клеточного мусора.
3. Как только клетки осядут, отсасывайте среду и мертвые клетки, оставляя около 10 мл среды, содержащей живые клетки.
4. Добавьте ~20 мл среды с низким содержанием bFGF (DMEM/F12 с добавлением 1x N2, 1x B27, 1x L-глутамина, 1x заменимой аминокислоты (NEAA), 0,05% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1 мМ монотиоглицерина (MTG) с добавлением 30 нг/мл bFGF).
5. Проверьте клетки на 2 день. Если большая часть клеток выглядит здоровой и яркой, ничего делать не нужно. Однако, если более трети клеток кажутся темными, замените среду (используя ту же технику наклона, что и в шаге 3.2) на ~20 мл среды с низким содержанием bFGF, дополненную 20 нг/мл bFGF.
6. На 3-й день замените половину среды (используя технику наклона в шаге 3.2) на 20 мл среды с низким содержанием bFGF, дополненную 10 нг/мл bFGF.
7. На 5-й день замените половину среды (используя технику наклона в шаге 3.2) 20 мл нейроиндукционной среды (NIM: DMEM/F12, 1x N2 добавка, 0,1 мМ MEM NEAA, 2 мкг/мл гепарина).
   заметка: Если есть какие-либо большие скопления клеток или органоидов, которые намного больше остальных, их следует удалить из культуры. Размер оценивается по внешнему виду под микроскопом; Например, с помощью окуляра с прицельной сеткой. Большинство органоидов имеют одинаковые размеры (примерно 100 ± 20 мкм). Мы удалили органоиды, которые были примерно в 2 раза меньше или больше остальных.
8. Заменяйте половину среды (~15 мл) (в технике наклона) на NIM через день.
9. После 3 недель в культуре добавьте 100-кратный пенициллин/стрептомицин в среду (NIM: DMEM/F12, 1x N2-добавка, 0,1 мМ MEM NEAA, 2 мкг/мл гепарина) в конечной концентрации 1x при желании. Обновляйте носители через день.
   заметка: Таким образом, мы сохраняли органоиды в культуре до 6 месяцев.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дополнение B27	Gibco, Уолтем, Массачусетс, США	17504-044
bFGF	Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США	PHG0263
БСА	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	А9647
Диспайз	STEMCELL Technologies, Ванкувер, Канада	7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	11330-032
ДПБС	Gibco, Уолтем, Массачусетс, США	10010023
Уменьшенный фактор роста Матригель (матрица)	Corning, Корнинг, штат Нью-Йорк, США	356231
H9 hESCs	WiCell, Мэдисон, Висконсин, США	ВА09
Гепарин	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	9041-08-01
L-глютамин	Gibco, Уолтем, Массачусетс, США	No 25030-081
Монотиоглицерин	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	М6145
Носители mTESR	STEMCELL Technologies, Ванкувер, Канада	85850
N2 НейроПлекс	Gemini Bio Products, Западный Сакраменто, Калифорния, США	400-163
NEAA	Gibco, Уолтем, Массачусетс, США	11140-050
Тритон Х-100	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	Т8787-100МЛ
Колбы T75 со сверхнизким креплением	Corning, Корнинг, штат Нью-Йорк, США	No 3814