1. Вентральная диссекция среднего мозга и спинного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги, кроме шагов 1.1.1−1.1.3 и 1.1.5−1.1.6 под флуоресцентным диссекционным стереомикроскопом. Общее время вскрытия за один эксперимент обычно составляет 3−5 часов, в зависимости от мастерства техники вскрытия и количества моторных нейронов, необходимых для каждого эксперимента.
- Вентральная диссекция среднего мозга
- Усыпьте беременную мышь примерно через 11,5 дней после оплодотворения углекислым газом и вывихом шейки матки.
- Тщательно опрыскайте брюшную полость этанолом и удалите матку с помощью стерильных микрорассекающих ножниц и щипцов для перевязки большого пальца. Кратковременно промойте матку в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS), затем переложите в диссекционную пластину, наполненную предварительно охлажденным стерильным PBS.
- Осторожно извлеките из матки IslMN:GFP (Islet motor neuron: зеленый флуоресцентный белок) эмбрионы с помощью стерильных микрорассекающих ножниц, щипцов для повязки большого пальца и пинцета Dumont #5 в ледяном стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) под ярким светом микроскопа. Используя стерильную мини-перфорированную ложку Moria, перенесите каждый эмбрион в отдельную лунку 24-луночного планшета, заполненную предварительно охлажденной средой Hibernate-E с низкой флуоресценцией с добавлением 1x B27. Держите 24-луночную тарелку на льду.
- Перенесите один эмбрион в стерильную пластину для вскрытия и полностью покройте ее ледяным стерильным сбалансированным раствором соли Хэнка (HBSS).
- Убедитесь, что этапы диссекции выполняются при освещении микроскопа флуоресцеином изотиоцианатом (FITC). С помощью пинцета удалите хвост и лицо эмбриона, не повреждая средний мозг (рисунок 1Ba). Поместите эмбрион в положение лежа так, чтобы конечности были расположены под ним, а хвост был направлен к передней части микроскопа, к диссектору (обозначен звездочкой, рисунок 1Bb).
- С помощью пинцета разрежьте крышу четвертого желудочка для того, чтобы создать небольшое отверстие. Используйте это отверстие, чтобы зацепить пинцетом пространство, образовавшееся между четвертым желудочком и его крышей. Рассекайте вдоль дорсальной поверхности эмбриона рострально к коре и латерально к нижней пластине и моторному столбу (рис. 1Ca, b). Вскрыть рассеченную ткань в открытой форме, чтобы выявить GFP-положительные ядра глазодвигательного нейрона (черепной нерв 3 [CN3]) и трохлеарного нейрона (черепной нерв 4 [CN4]).
Примечание: Теперь будет открыт небольшой кусочек ткани из вентрального среднего мозга, содержащий мезенхиму, CN3 и CN4.
- Осторожно отделите вентральный средний мозг от эмбриона и удалите менингеальную ткань с помощью пинцета и микроножа. Препарируйте двусторонние GFP-положительные ядра CN3 и CN4 вдали от напольной пластины и других GFP-отрицательных окружающих тканей с помощью пинцета и ножа для микрорассечения (рис. 1D). Увеличьте количество GFP-положительных моторных нейронов в иссеченной ткани, но избегайте прикосновения к ним или их повреждения.
- Если вы хотите получить набор отдельных ядер CN3 и CN4, разрежьте их по средней линии этих двух ядер (желтая пунктирная линия на рисунке 1D). С помощью пипетки P1000 соберите рассеченную вентральную ткань среднего мозга с минимальным HBSS и поместите ее в маркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл, заполненную средой для препарирования. Хранить на льду до диссоциации.
- Продолжайте объединять вентральные промежуточные мозги из дополнительных эмбрионов в той же пробирке до тех пор, пока общее количество не будет соответствовать экспериментальному требованию (идеальное количество клеток см. в шаге 4).
Примечание: Рекомендуется объединенная коллекция, состоящая по меньшей мере из 10 вентральных средних мозгов, дающая примерно 1 x 10 4 моторных нейронов CN3/CN4, поскольку ткани подвергаются стрессу во время диссоциации и сортировки.
- Вентральная диссекция спинного мозга
- Держите эмбрион лежа так, чтобы головка была обращена к передней части микроскопа, к диссектору. Удерживайте эмбрион одной парой пинцетов и введите кончик другой пары пинцетов в нераскрытую каудальную часть четвертого желудочка.
- Откройте остальную часть заднего мозга и спинного мозга дорсально по всей рострокаудальной длине эмбриона. Вскрыть путем разрезания дорсальной ткани, начиная с четвертого желудочка и двигаясь к центральному каналу каудального спинного мозга, используя щипцы в качестве ножниц (рис. 1Ca, b). Будьте осторожны, чтобы не прикасаться к вентральному спинному мозгу или не повреждать его во время этой процедуры.
- Держите эмбрион одним пинцетом и отщипните лоскут тыльной ткани с каждой стороны другой парой пинцетов (рис. 1Ea, b).
ПРИМЕЧАНИЕ: Иссеченные дорсальные ткани содержат дорсальную кожу, мезенхиму, ганглии дорсальных корешков (DRGs), дорсальный задний мозг и спинной мозг. Удалите как можно больше этих тканей, не повреждая ядра спинальных моторных нейронов (SMN), потому что они являются адгезивными и могут захватывать SMN во время фильтрации или вызывать закупорку во время флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS).
- Удалите вентральный спинной мозг с помощью ножа для микродиссекции, чтобы проколоть его непосредственно под GFP-положительным SMN. Поднимите вентральный отдел спинного мозга пилообразными движениями с обеих сторон (рис. 1Fa, b). Разрежьте плавающий вентральный спинной мозг поперечно прямо над C1, где выступает первый GFP-положительный передний рог (рис. 1G). Также разрежьте поперечно по верхней границе нижней конечности (рисунок 1G). После этой процедуры удалите шейный (C1)-поясничный (L2-L3) отдел вентрального спинного мозга.
- Поместите вентральный отдел спинного мозга дорсальной стороной вверх и удерживайте, прижимая GFP-отрицательную ткань между GFP-положительными столбцами SMN одной парой пинцетов. Удалите оставшуюся прикрепленную мезенхиму, DRG и дорсальный спинной мозг, обрезав обе стороны GFP-положительного столбика SMN ножом для микродиссекции (Рисунок 1H). Позаботьтесь о максимальном увеличении GFP-положительных моторных нейронов, не повреждая их.
- С помощью пипетки P1000 соберите рассеченную вентральную ткань спинного мозга с минимальным HBSS и поместите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл с маркировкой SMN, заполненную диссекционной средой. Хранить на льду до диссоциации. Продолжайте объединение вентральных спинных мозгов из дополнительных эмбрионов в той же трубке до тех пор, пока общее количество не будет соответствовать экспериментальным требованиям.
заметка: Рекомендуется собрать не менее трех вентральных спинных мозгов с получением примерно 2,1 x 104 SMN, поскольку ткани подвергаются напряжению во время диссоциации и сортировки.
- Соберите лицевые моторные нейроны и конечности эмбрионов мышей IslMN:GFP в качестве GFP-положительного и GFP-отрицательного контроля для флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) соответственно. Конечности являются GFP-отрицательными, потому что GFP-положительные аксоны SMN еще не распространились в конечности в этом эмбриональном возрасте.
2. Диссоциация тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время диссоциации обычно составляет 1,5 часа на эксперимент.
- Подогреть раствор папаина и альбумин-овомукоидного ингибитора аликвотами до 37 °С за 30 мин до диссоциации.
- Кратковременно раскрутите микрорассеченные ткани с небольшой скоростью.
- С помощью пипетки P100 осторожно удалите как можно больше Hibernate E без аспирации тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно удалите весь остаточный гибернат Е после этого этапа, чтобы избежать снижения эффективности диссоциации папаина на следующем этапе.
- Добавьте соответствующий объем раствора папаина (Таблица 1) в каждую из микроцентрифужных пробирок объемом 1,7 мл, содержащих микропрепарированные образцы тканей.
Примечание: Был определен подходящий объем папаина для диссоциации с целью максимизации эффективной диссоциации при минимизации нагрузки на клетки.
- Аккуратно разотрите 8 раз с помощью пипетки P200. Выполняйте все этапы растирания аккуратно, чтобы сохранить жизнеспособность двигательных нейронов.
- Инкубируйте пробирки, содержащие ткани, в течение 30 минут при температуре 37 °C, взбалтывая, взмахивая пальцами 10 раз каждые 10 минут. После инкубации осторожно растирайте каждую суспензию 8 раз с помощью пипетки P200. Вращайте ячейки при 300 x g в течение 5 минут.
- Чтобы убедиться в эффективности ингибирования овомукоидов на следующем этапе, используйте пипетку P1000 для удаления и отбрасывания как можно большего количества надосадочной жидкости без аспирации тканей.
- Ресуспендируйте гранулы в соответствующем объеме раствора альбумин-овомукоидного ингибитора (табл. 1) путем осторожного растирания 8 раз с помощью пипетки P200.
- Подождите 2 минуты, чтобы оставшиеся кусочки недиссоциированной ткани осели на дно трубки.
- Соберите как можно больше надосадочной жидкости без аспирации недиссоциированных тканей с помощью пипетки P200. Перенесите надосадочную жидкость в свежие микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл.
- Если некоторые участки ткани остаются недиссоциированными после шага 2.10, повторите шаги 2.8−2.10 для недиссоциированных тканей, которые остаются в исходных микроцентрифужных пробирках объемом 1,7 мл, чтобы максимизировать конечный выход диссоциированных клеток при минимизации нагрузки на ранее диссоциированные клетки, содержащиеся в надосадочной жидкости на стадии 2.10.
- Вращайте ячейки при давлении 300 x g в течение 5 мин. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000.
- Повторно суспендируйте гранулу в соответствующем объеме среды для рассечения (Таблица 1) путем 8-кратного пипетирования с помощью пипетки P1000. Соответствующий объем конечной суспензии определяли таким образом, чтобы плотность клеток не превышала10-7 клеток/мл, что может блокировать поток проточной цитометрической машины, а также чтобы клетки не разбавлялись чрезмерно, что приводит к замедлению скорости сортировки.
- Отфильтруйте суспензии через клеточные фильтры размером 70 мкм, чтобы удалить большие комки или непереваренную ткань. Переложите суспензию в пробирки из полистирола объемом 5 мл с круглым дном и храните на льду до тех пор, пока не потребуется.
3. Флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован с использованием сортировщика FACS, оснащенного фиолетовым лазером мощностью 15 мВт 405 нм, синим лазером мощностью 100 мВт 488 нм, оранжевым лазером мощностью 75 мВт 594 нм и красным лазером мощностью 40 мВт 640 нм. Клетки сортировали как жидкость оболочки в стерильном PBS в асептических условиях через сопло 100 мкм. Чтобы свести к минимуму напряжение клетки, скорость потока была установлена на давление образца 1−3, так что было получено максимум 1000−4000 событий в секунду. Общее время FACS обычно составляет 1−2 часа на эксперимент.
- Настройте напряжения для прямого и бокового рассеяния, чтобы можно было правильно визуализировать популяцию клеток. Настройка соответствующего напряжения для сортировки ячеек является сложной задачей и требует опытного оператора FACS.
- Чтобы различать различные популяции клеток, стройте графики ячеек на основе размера, определяемого областью прямого рассеяния (FSC-A), и внутренней сложности, определяемой областью бокового рассеяния (SSC-A). Нарисуйте ворота вокруг живых клеток, как показано на рисунках 2Aa и Ba, чтобы исключить мусор и мертвые клетки. Сгруппируйте клетки в пределах закрытой области как популяцию 1 (P1).
- Чтобы исключить скопления и дублеты ячеек, постройте следующие ячейки P1 на основе ширины бокового рассеяния (SSC-W) и SSC-A. Задайте популяцию одиночных клеток как популяцию 2 (P2) (рис. 2Ab и рис. Bb).
- Построение графика ячеек P2 на основе ширины прямого рассеяния (FSC-W) в зависимости от FSC-A и определение популяции одиночных клеток как популяции 3 (P3) (рисунок 2Ac и рисунок Bc).
заметка: Использование двух последовательных стробов в 3.3 и 3.4 исключает скопления ячеек и дублеты (высокий FSC-W и высокий FSC-A).
- Gate P3 клетки на основе GFP в сравнении с аллофикоцианином (APC). Канал APC обнаруживает автофлуоресценцию. Стробирование на этом канале позволяет избежать захвата автофлуоресцентных клеток. Используйте GFP-отрицательные элементы для регулировки напряжения для флуоресцентных каналов FITC/GFP. В идеале затворы для этих клеточных популяций должны располагаться примерно в 102. Выберите пороговые значения ворот для GFP-положительной популяции 4 (P4) индивидуально для каждого типа моторных нейронов (рисунок 2Ad и рисунок Bd).
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите вентиль GFP намного выше для SMN, чем для CN3s/CN4, чтобы получить чистую культуру (Рисунок 2Ad и Рисунок Bd). Более низкие ворота GFP для культур SMN приводят к контаминации культур глией и немоторными нейронами. Вероятно, это связано с тем, что в некоторых глиях и немоторных нейронах наблюдается низкий уровень экспрессии GFP из-за утечки промотора. Процент GFP-положительных клеток по сравнению с общим количеством клеток обычно составляет 0,5−1,5% для CN3s/CN4 и 1,5−2,5% для SMN. Если вскрытие прошло успешно, эти числа могут быть использованы в качестве ориентира для определения подходящего положения GFP-положительного вентиля (Рисунок 2Ae и Рисунок Be).
- Выполняйте FACS в соответствии с протоколом производителя. Соберите Р4-клетки в свежие микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл, заполненные 500 мкл питательной среды для мотонейронов. Хранить на льду до нанесения покрытия.
заметка: Хотя ячейки можно сортировать непосредственно в лунках, это приводит к неравномерному количеству ячеек в лунке. Отсортируйте ячейки в микроцентрифужные пробирки объемом 1,75 мл, а затем вручную наложите их на планшеты, чтобы добиться более равномерного распределения покрытия.
4. Культура очищенных первичных мотонейронов
- Разбавлять выделенные FACS суспензии CN3/CN4 и SMN средой для культивирования моторных нейронов, предварительно подогретой до 37 °C до плотностей 5 x 103 и 1 x 104 клеток/мл соответственно.
заметка: Один эмбрион E11.5 дает примерно 1 x 103 CN3/CN4 и 7 x 103 SMN. Тем не менее, эти результаты в значительной степени зависят от чистоты рассеченных тканей, тщательности диссоциации клеток и соответствующего порогового значения GFP-ворот во время FACS.
- Перенесите 96 луночных планшетов, предварительно покрытых поли-D-лизином (PDL) и ламинином, из инкубатора для тканевых культур при температуре 37 °C в ламинарный проточный колпак и аспирируйте ламинин из каждой лунки. Используйте пластины и покровные стекла сразу, не стирая.
- Добавьте 200 мкл разбавленных суспензий CN3/CN4 и SMN в каждую лунку 96-луночных планшетов, покрытых PDL/ламинином. Конечная плотность ячеек должна составлять 1 x 103 и 2 x 103 ячейки/лунку для CN3/CN4 и SMN, соответственно.
заметка: Начальная плотность покрытия SMN в 96-луночных планшетах (2 x 103 ячейки/лунка) в два раза выше, чем у CN3s/CN4s (1 x 10,3 ячейки/лунка) для получения аналогичного конечного количества и плотности моторных нейронов через 2 и 9 дней in vitro (DIV) (4−6 x 102 и 2−4 x 102 клеток на лунку), соответственно).
- Культивируйте нейроны в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%CO2.
- Питайте нейроны каждые 5 дней, удаляя половину старой среды (100 мкл) и заменяя ее таким же объемом свежей среды для культивирования моторных нейронов. Убедитесь, что нейронные процессы становятся видимыми на 1 DIV и становятся толще и длиннее на 14 DIV (рис. 3). Тела нейронных клеток увеличиваются и имеют тенденцию к агрегации в долговременных культурах, особенно для SMN (рис. 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все изменения среды и растворов, оставляя половину исходного объема среды, чтобы избежать отслоения культивируемых клеток. Это включает в себя этапы фиксации и иммуноцитохимии (ИКХ). Если удалить все среды, независимо от того, насколько мягко, большая часть клеток отсоединится и будет смыта.
