Работа с культурами нейронных стволовых клеток на предприятии по производству клеток

Аннотация

Источник: Stover, A. E., et al,. Культивирование плюрипотентных и нейральных стволовых клеток человека в закрытой системе культивирования клеток для фундаментальных и доклинических исследований. J. Vis. Exp. (2016).

В видео описывается процедура поддержания контролируемой среды на рабочей станции для культивирования клеток для роста и поддержания нейрональных стволовых клеток. Эти процедуры включают в себя установление условий в камере, протоколы очистки и подготовку среды, что позволяет сохранить максимальную стерильность и воспроизводимость и заменить традиционные методы.

Протокол

1. Первоначальная настройка

1. Настройка концентраций газа и температуры
   1. Используя программное обеспечение, нажмите на вкладку «Гость» в левом верхнем углу графического интерфейса. Авторизуйтесь в системе, используя указанные логин и пароль. Убедитесь, что у каждого пользователя есть свое имя пользователя и пароль.
   2. Нажмите на модуль для настройки (рисунок 1). В новом окне, отображающем текущие настройки, нажмите на существующее значение O₂ в разделе "Set point" и введите требуемый для этого модуля уровень концентрации O₂. Введите 5%_O2, если в этом модуле будут выращиваться или манипулироваться плюрипотентные стволовые клетки, и 9%_O2, если будут выращиваться или манипулироваться нейральные стволовые клетки. Нажмите на зеленую галочку, чтобы подтвердить заданное значение.
      заметка: Два модуля не регулируются газом: ламинарный колпак и камера микроскопа. Концентрации газов в ламинарном проточном колпаке являются атмосферными, в то время как концентрации газов в технологической камере пассивно сохраняются на уровне концентраций в камере микроскопа.
   3. Повторите этот шаг для_CO2. Введите заданное значение 5%_CO2 для всех модулей, за исключением буферных камер, которые регулируют только O₂.
   4. Контролируйте текущие концентрации газов с пометкой «технологические значения», чтобы убедиться, что они достигают новых заданных значений.
   5. Отрегулируйте уставки газа всех модулей на соответствующие значения. Сопоставьте уровни CO₂ и O₂ с камерами, которые будут подвергаться воздействию друг друга. Например, отрегулируйте технологическую камеру до 5%_O2 перед открытием инкубатора, в котором клетки выращиваются при 5%_O2. Кроме того, измените концентрацию на 5%_O2 в любой буферной камере, используемой для добавления предметов в технологическую камеру в течение этого времени.
   6. Установите температуру технологической камеры на 37 °C с помощью того же экрана для регулировки газа. Кроме того, температура пола технологической камеры должна быть установлена на уровне 37 °C.
   7. Нажмите на банки инкубационных модулей под каждым инкубатором. Отрегулируйте температуру банок до 37 °C.
2. Эксплуатация буферных камер
   1. Соберите все необходимые материалы для выполнения данной задачи (кормление, раскалывание, окрашивание и т.д.) в начале, чтобы предотвратить задержки в рабочем процессе. Обильно распылите на все материалы 70% этанол и дайте им высохнуть в ламинарном колпаке. Не распыляйте колбы или пластины с клетками — аккуратно протрите их стерильной марлевой губкой, пропитанной 70% этанолом.
   2. Убедитесь, что наружные и внутренние дверцы буферной камеры надежно закрыты. Затем откройте наружную дверцу и поместите предметы внутрь.
   3. Закройте наружную дверцу. Выберите буферный модуль в программном обеспечении и перейдите на вкладку «Коэффициент разбавления». Введите единицу в поле логарифмического коэффициента. Нажмите start.
      Примечание: «Коэффициент разбавления» означает, что атмосфера буферного модуля будет откачана и заменена чистым газом, отфильтрованным методом HEPA.
   4. Как только графический интерфейс перестанет мигать «коэффициентом разбавления», откройте внутреннюю дверцу буферной камеры и поместите материалы внутрь технологической камеры.
      Внимание: Не позволяйте внутренней и наружной дверцам открываться одновременно, а также не открывайте внутреннюю дверцу, если буферная камера не подверглась воздействию коэффициента разбавления.
   5. Во-первых, удалите предметы из технологической камеры и убедитесь, что буферная камера подверглась воздействию коэффициента разбавления. Затем откройте внутреннюю дверцу, поместите внутрь предметы, которые нужно убрать, и закройте внутреннюю дверцу. Затем откройте наружную дверцу и уберите предметы.
      Примечание: Перед открытием наружной дверцы нельзя использовать коэффициент разбавления.

2. Введение и питание клеток

1. Настройка инкубатора
   1. Поместите 3 чашки Петри в поддон для воды у основания каждого инкубатора. Заливайте такую посуду стерильной водой, не заполняя непосредственно кастрюлю. Поддерживайте уровень воды в этих чашках, так как они имеют решающее значение для поддержания заданной относительной влажности (RH) в инкубаторах.
   2. В графическом интерфейсе нажмите на инкубатор. Под заданным значением нажмите на существующее значение относительной влажности (RH) и введите 85%. Нажмите на зеленую галочку, чтобы принять это значение.
2. Подготовка производства ячеек к клеткам
   1. Если это еще не сделано, отрегулируйте буферные камеры, технологическую камеру и инкубатор в соответствии с заданными значениями газа, необходимыми для типа вводимой клетки.
   2. Очистите поверхность технологической камеры стерильной марлей и негорючим дезинфицирующим средством. Не используйте дезинфицирующее средство на основе надуксусной кислоты; В закрытой системе сильные, задерживающиеся пары токсичны для клеток млекопитающих. Вместо этого используйте средства на основе хлорида бензалкония.
   3. Продолжайте дезинфекцию. Очистите перчатки и поверхности, к которым часто прикасаются, такие как дверные ручки. Используйте дезинфицирующее средство тщательно, но экономно, так как избыток жидкости в технологической камере будет способствовать влажности, конденсации и возможному росту микроорганизмов.
   4. Очистите поверхность ламинарного проточного колпака и буферной камеры 70% этанолом и дайте ему высохнуть. Поместите колбу или пластину с клетками (в нашем случае ПСК (плюрипотентные стволовые клетки) или НСК (нейральные стволовые клетки)) в капюшон и кратко протрите его внешнюю поверхность стерильной марлевой губкой, пропитанной этанолом.
   5. Поместите колбу или планшет в буферную камеру и запустите коэффициент разбавления (шаг 1.2.3).
   6. По завершении разведения фактора немедленно переместите колбу или тарелку в соответствующий инкубатор. Поскольку инкубаторы находятся в задней части технологической камеры, выдвиньте полку в технологическую камеру для размещения клеток. Избегайте ненужного или длительного открытия дверей инкубатора, так как воздух в технологической камере очень сухой по сравнению с воздухом в инкубаторах, что приведет к значительной потере влажности в инкубаторе.
3. Кормление клеточных культур
   1. Соберите компоненты среды, такие как серологические пипетки, электронный пипетка, марля и дезинфицирующее средство. Также соберите контейнер для отходов для отработанной клеточной питательной среды, но не заполняйте его отбеливателем. Подайте материалы в технологическую камеру через буферную камеру, как описано в разделе 1.2. Расставьте материалы таким образом, чтобы обеспечить оптимальное рабочее пространство. Избегайте размещения неиспользуемых предметов в центре технологической камеры.
   2. Оставьте контейнер для носителя слегка приоткрытым, чтобы среда могла сбалансироваться с уровнями CO₂ и_O2, присутствующими в системе. Некоторые производители сред PSC не рекомендуют нагревать среду при 37 ºC; Если это так, используйте буферную камеру для балансировки среды. Дайте среде сбалансироваться в течение 20 минут.
   3. Удалите старую среду из лунок с помощью соответствующей стереологической пипетки и электронного пипетка. Для ПСК удалите все оставшееся количество старой среды, за исключением небольшого, чтобы предотвратить высыхание в процессе кормления. Для НСК удалите половину старой среды. Переложите отходы в контейнер для отходов.
   4. Поместите использованную пипетку обратно в оригинальную обертку и переместите ее в сторону технологической камеры или в буферную камеру, предназначенную для удаления отходов. С помощью свежей стерильной серологической пипетки добавьте свежую среду в планшеты для клеточных культур и поместите планшеты обратно в предназначенный для них инкубатор.
   5. По окончании подачи опрыскать марлю дезинфицирующим средством и тщательно очистить пол и дверные ручки технологической камеры. Если в системе выращивается несколько клеточных линий, стерилизуйте между кормлением каждую клеточную линию. Это помогает свести к минимуму риск перекрестного загрязнения.
   6. По завершении удалите отходы или другие ненужные предметы через одну из буферных камер
   .

3. Расщепление клеточных культур

1. Ферментативное пассирование ПСК или НСК
   1. Соберите все необходимые для прохождения предметы. К ним относятся среды, ферменты или неферментативные буферы для диссоциации клеток (последний предназначен только для НСК), DPBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко), планшеты или колбы, внеклеточный матрикс (ECM), конические трубки и серологические пипетки. Вводят их в систему с помощью буферной камеры.
   2. Смазываем свежие тарелки или колбы с ЭХМ, как описано ранее 9,10. Некоторые ЭКМ, например, полученные из клеточных линий саркомы мышей, являются жидкими только при температуре от 4 до 15 °C, поэтому используйте стерилизованный холодный блок или гелевый пакет со льдом, чтобы сохранить ЭКМ холодным во время работы в нагретой технологической камере.
   3. Отожмите отработанную среду от культуры и утилизируйте ее в контейнере для отходов.
   4. Промойте поверхность лунки или колбы 1 мл DPBS/лунки и утилизируйте DPBS.
   5. Добавьте в каждую лунку по 1 - 2 мл теплого фермента. Только очень плотные культуры требуют 2 мл.
   6. Немедленно переместите чашку или колбу для культивирования в камеру микроскопа и понаблюдайте за культурой. Следите за признаками того, что отдельные клетки начинают отслаиваться от посуды. Не ждите, пока клетки всплывут во взвешенном состоянии, прежде чем переходить к следующему этапу.
   7. Верните ячейки в основную рабочую камеру. С помощью серологической пипетки объемом 5 мл добавьте 4 мл DPBS на каждый 1 мл фермента, а затем с усилием проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы вытеснить клетки с поверхности лунки. При прохождении нескольких лунок в многослойной пластине добавьте DPBS в каждую лунку перед вытеснением ячеек из отдельных лунок.
   8. Перенесите фермент и суспензию клеток PBS в коническую пробирку соответствующего размера.
   9. Если центрифуга недоступна на предприятии по производству ячеек, плотно запечатайте коническую трубку, поместите ее в буферную камеру и закройте дверцу.
   10. Извлеките коническую трубку из буферной камеры со стороны ламинарного потока и вращайте ячейки при давлении 100 x g в течение 5 минут при RT.
   11. Распылите на коническую трубку 70% этанола и подайте ее в технологическую камеру с помощью буферной камеры и коэффициента разбавления.
   12. Отпижьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 2 мл среды ПСК или НСК. При прохождении ПСК включите в среду ингибитор ROCK(Rho-ассоциированная протеинкиназа) в концентрации 10 мкМ.
   13. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и определите необходимые лунки или пластины. Пластина ПСК при 5 х 10⁴ - 1 х 10⁵ ячеек/см². Разделите НСЦ в соотношении 1:2.
       Примечание: НСК часто слипаются и не поддаются точному подсчету в гемоцитометре.
   14. Если требуется криоконсервация клеток, убедитесь, что все материалы и замораживающие среды подготовлены и помещены внутрь технологической камеры. ДМСО (диметилсульфоксид) очень токсичен для клеток при 37 ºC, поэтому действует быстро. Храните контейнер для заморозки с изопропаноловой рубашкой при температуре RT в колпаке с ламинарным потоком. После того, как флаконы для криоконсервации будут заполнены и запечатаны, немедленно извлеките их из технологической камеры, пропустив через буферную камеру.
2. Ручная передача PSC
   1. Подтвердите, что культуру нужно сдать, как описано ранее. Если это так, приготовьте свежие тарелки или колбы, покрытые внеклеточным матриксом. Затем полностью смените носитель.
   2. Очистите камеру микроскопа стерильной марлей, смоченной в щадящем количестве негорючего дезинфицирующего средства — слишком большое количество приведет к чрезмерному запотеванию. Очищайте только перчатки, пол и сцену. Внесите в камеру несколько наконечников пипеток объемом 200 мкл или 1 000 мкл в индивидуальной упаковке.
   3. Поместите пластину с ПСК в камеру микроскопа, снимите крышку и положите ее лицевой стороной вниз на свежевымытый пол. Если оставить крышку поднятой, нижняя сторона подвергается прямому воздействию воздушных потоков и потенциального загрязнения.
   4. Разверните наконечник пипетки и, используя микроскоп для визуализации культуры, выделите колонии с хорошей морфологией с помощью кончика пипетки.
      Примечание: Наконечник пипетки можно прикрепить к пипетке, если пользователь сочтет это более удобным.
   5. Установите на место крышку на пластине и переместите пластину обратно в технологическую камеру.
   6. Отпижите излишки ECM от новой пластины и перенесите среду со старой пластины (содержащей частицы колонии во взвешенном состоянии) на новую пластину. Если на старой тарелке все еще есть колонии, которые не готовы к сбору, подкормите и их.

Результаты

Рисунок 1. Графический интерфейс для производства ячеек. (A) Графическое представление CPF является экраном по умолчанию и соответствует чертежу САПР, показанному на рисунке 3. Щелчок мышью по буферному модулю 1 открывает его экран управления (B), где значения O₂ установлены в соответствии с камерой обработки. Аналогичным образом, при нажатии на технологич...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Система Xvivo	Биосферикс	Изготовление на заказ
Программное обеспечение Xvivo	Биосферикс	Версия i.o.2.1.2.1
Коллектор O2	Амико	-М2Н-К3-С-У-ОКСИ
Коллектор CO2	Амико	M2H-C3-D-U-CO2
Коллектор N2	Западный инноватор	СТМ75-7-2-2-БМ
Газ O2
Газ CO2
Газ N2
чашка Петри
Вода
Стерильная марля
70% этанол	BDH	BDH1164-4LP
Дезинфицирующее средство на основе бензалкония хлорида
Фосфатный буферный раствор Дульбекко
Буфер диссоциации клеток на основе Хэнка	Технологии Life	13150-016
2 мл серологической пипетки	ВВР	89130-894
5 мл серологической пипетки	Olympus Plastics	12-102
10 мл серологической пипетки	Olympus Plastics	12-104
25 мл серологической пипетки	Olympus Plastics	12-106
50 мл серологической пипетки	Olympus Plastics	12-107
6-луночный планшет	Корнинг	353046
Наконечники для пипеток объемом 20 мкл	Эппендорф	22491130
Наконечники для пипеток объемом 200 мкл	Эппендорф	22491148
1000 наконечников для пипеток	Эппендорф	22491156
Микроскоп с камерой DP21 и флуоресценцией	Корпорация Olympus	СКХ41
Фосфатно-буферизованный натрий	Гиклон	9236
Диметилсульфоксид	Протид	ПП1130
Перчатки