Линия индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC), HPS1006, была предоставлена RIKEN BRC через Национальный проект биоресурсов MEXT/AMED, Япония.
1. Индукция дифференцировки hiPSC в эндотелиальные клетки-предшественники (EPC)
- Планшеты и реагенты с покрытием из внеклеточного матрикса (ВКМ)
- Подготовьте 12-луночные планшеты с базальной мембраной, покрытые матрицей, путем выделения 2,5 мг матричного геля в центрифужные пробирки объемом 50 мл для хранения при температуре -20 °C в течение 6 месяцев. Добавьте в пробирку 30 мл холодной модифицированной Dulbecco смеси среды/питательных веществ F-12 (DMEM/F12), которая хранилась в холодильнике (4 °C). Осторожно перемешайте с помощью пипетирования, пока гель не оттает, а затем добавьте по 500 мкл раствора в каждую лунку 12-луночного планшета. Поместите планшет в инкубатор (37 °C, 5%CO2) не менее чем на 1 ч.<бр/>
заметка: Матричный гель базальной мембраны чувствителен к температуре, и с ним следует обращаться в соответствии с инструкциями производителя по аликвотированию и покрытию пластин. Концентрация белков внеклеточного матрикса может варьироваться между партиями. Для обеспечения точности точная концентрация должна быть указана в сертификате качества для конкретной партии, используя номер партии. Например, если точная концентрация составляет 10,0 мг/мл, используйте 250 мкл геля, чтобы получить в общей сложности 2,5 мг.
- Готовьте стоковый раствор ингибитора рокиназы (ROCK) путем растворения ингибитора ROCK в стерильной воде до концентрации 10 мМ (табл. 1). Разбавьте исходный раствор объемом 100-200 мкл и храните при температуре -20 °С, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания.
- Приготовьте стоковый раствор L-аскорбиновой кислоты в концентрации 100 мг/мл, растворив 5 г L-аскорбиновой кислоты в 50 мл стерильной воды, и храните при температуре -20 °C (Таблица 1). Добавьте 6,25 мл глутамина и 305 мл исходного раствора L-аскорбиновой кислоты в 500 мл усовершенствованного DMEM/F12 для получения среды LaSR (Таблица 1). Хранить при температуре 2-8 °C до 2 недель.
- Приготовьте CHIR99021 раствор, растворив CHIR99021 в неразбавленном диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации 10 мМ (табл. 1). Разложите раствор по 100-200 μл объемов, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания, и храните при температуре -20 °C до 1 года. Хранить рабочие аликвоты стокового раствора при температуре 4 °С до 1 месяца.
- Приготовьте среду DMEM/F12-10, добавив 50 мл инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки к 450 мл DMEM/F12. Хранить среду при температуре 2-8 °C до 1 месяца (Таблица 1).
- Приготовьте проточный буфер-1 путем добавления 33,3 мл 7,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) к 467 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) Дульбекко (Таблица 1). Хранить при температуре 2-8 °C до 6 месяцев.
- Посев сингуляризованных ИПСК и расширение для дифференцировки ЭПК (день -3 по день -1)
- Дифференцировку начинают, когда колонии hiPSC в 6-луночном планшете не демонстрируют спонтанной дифференцировки и имеют соответствующую плотность для пассирования, обычно около 80% конфлюенции (2,5-3,5 x 106 клеток). Внимательно наблюдайте за спонтанно дифференцированными клетками под микроскопом, чтобы убедиться, что для элиминации недифференцированных клеток требуются множественные пассажи. Обратитесь к приведенному ниже примечанию к шагу 1.4.15 для получения информации о среде для культивирования клеток и внеклеточном матриксе.
- Отсадите среду и добавьте в лунки 1 мл диссоциационного реагента и инкубируйте в течение 5-7 мин при 37 °C. Диссоциируйте и разделите клетки, осторожно нанеся раствор диссоциационного реагента пипетированием на поверхность лунок два или три раза.
- Перенесите отделенные клетки в пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл поддерживающей среды hiPSC, и тщательно ресуспендируйте клетки. Зарезервируйте аликвоту 10 мкл для подсчета клеток.
- Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение 5 мин при 200 x g при 20-25 °C. Подсчитайте ячейки и рассчитайте необходимый объем для достижения соответствующей плотности ИПСК (75-400 x 103 на лунку) в 12-луночном планшете, покрытом базальной мембраной (шаг 1.1.1).
- Отсадите раствор покрытия из лунок и добавьте в каждую лунку 1 мл среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK (разведение 1:1000). После центрифугирования аспирировать надосадочную жидкость и диссоциировать гранулу в 1 мл среды hiPSC.
- Добавьте необходимый объем ИПСХ, определенный на шаге 1.2.4, в каждую лунку 12-луночного планшета. От двух до четырех 12-луночных планшетов может быть достаточно для дифференциации клона hiPSC. Обратитесь к шагу 1.2.4 для определения количества пластин, необходимых для засева ячеек.
- Поместите планшет в инкубатор (37 °C, 5%CO2). Равномерно распределите ячейки, осторожно перемещая пластину вперед и назад, а затем из стороны в сторону в инкубаторе.
- На следующий день (т.е. на день -2) замените среду на 2 мл поддерживающей среды hiPSC, в которой отсутствует ингибитор ROCK. На следующий день (День -1) замените среду на 2 мл свежей поддерживающей среды hiPSC.
- Индукция ЭПК ингибитором гликогенсинтазы киназы 3 (GSK-3) CHIR99021 (день 0 - день 5)
- В день 0 замените поддерживающую среду hiPSC в каждой лунке 2 мл среды LaSR, содержащей 8 мкМ CHIR99021.
- В 1-й день аспирируйте среду и добавьте 2 мл свежей среды LaSR, содержащей 8 мкМ CHIR99021.
- На 2, 3 и 4 дни замените среду 2 мл свежей среды LaSR, которой не хватает CHIR99021.
- Магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS) для очистки CD31+ EPC (день 5)
- На 5-й день аспирируйте среду, а затем добавьте по 1 мл диссоциационного реагента в каждую лунку перед инкубацией в течение 6-8 мин при 37 °C.
- Диссоциируйте и разделите клетки с помощью микропипетки и пропустите через клеточный фильтр размером 40 мкм для фильтрации суспензии в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл среды DMEM/F12-10. Клеточную суспензию, собранную из более чем двух 12-луночных планшетов, отфильтровать по меньшей мере в две пробирки объемом 50 мл.
- Остановите реакцию пищеварения, добавив среду DMEM/F12-10 (до 50 мл). Тщательно пипетируйте и оставьте 10 мкл для подсчета ячеек. Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение 5 минут при 200 x g при 20-25 °C.
- После удаления надосадочной жидкости добавьте 10 мл среды DMEM/F12-10 и переложите клеточную суспензию в свежие пробирки объемом 15 мл. Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение 5 минут при 200 x g при 20-25 °C.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте в буфер потока-1 с плотностью 1,0 х 10 7 клеток на 100 мкл буфера.
- Добавьте реагент, блокирующий Fc-рецептор (FcR) в соотношении 1:100 и инкубируйте в течение 5 минут перед добавлением меченного флуоресцеином изотиоцианата (FITC) антитела CD31, разбавленного в соотношении 1:200. Выдержать суспензию в течение 30 минут в темноте при температуре 20-25 °С.
- Добавьте 10 мл проточного буфера-1, зарезервировав 10 мкл суспензии для анализа проточной цитометрии для определения фракции CD31+ клеток (рис. 1).
- Гранулируйте клетки центрифугированием при 200 x g в течение 5 минут при 20-25 °C. Затем удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют до плотности 1,0 х 107 клеток на 100 мкл проточного буфера-1 раствора. Добавьте отборочный коктейль FITC (5 μл на 100 μл клеточной суспензии). Тщательно перемешать пипеткой и выдерживать в темноте 15 минут при температуре 20-25 °C.
- Добавьте 5 мкл магнитных наночастиц на 100 мкл клеточной суспензии, хорошо пипетируйте и инкубируйте в темноте в течение 10 мин при 20-25 °С.
- Перенесите клеточную суспензию в пробирку для проточной цитометрии объемом 5 мл и добавьте проточный буфер-1 для достижения общего объема 2,5 мл. Поместите пробирку проточной цитометрии в магнит на 5 минут.
- Непрерывным движением инвертируйте магнит и сцеживайте клеточную суспензию, содержащую клетки, которые не были помечены антителом FITC-CD31. Удерживайте магнит и трубку в перевернутом положении в течение 2-3 с, а затем удалите остатки жидкости. Отсадите все капли с края трубки, прежде чем вернуть трубку в вертикальное положение.
- Возьмите пробирку проточной цитометрии из магнита и добавьте 2,5 мл проточного буфера-1 для промывания оставшихся клеток CD31+. Ресуспендируйте клетки, осторожно пипетируя клетки вверх и вниз два или три раза. Поместите проточную трубку в магнит на 5 минут.
- Повторите шаги 1.4.11-1.4.12 три раза, а затем шаг 1.4.11 еще раз, всего четыре стирки.
- Снимите проточную трубку с магнита и добавьте указанное количество подходящей среды (например, среды, не содержащей эндотелиальной сыворотки крови человека [hECSR] для расширенного культивирования EC или замораживающей среды для замораживания) в трубку для ресуспендирования очищенных CD31+ клеток. Резервируйте две аликвоты суспензии по 10 мкл, одну для подсчета клеток, а вторую для проведения анализа проточной цитометрии с целью оценки чистоты клеток CD31+ в образцах после MACS (рис. 1). Если проточный цитометр недоступен немедленно, храните аликвоту при температуре 4 °C до анализа.
- Заморозьте CD31+ EPC на этом этапе.
заметка: 12-луночные планшеты с покрытием из витронектина и более стабильная поддерживающая среда hiPSC (mTeSR plus) могут использоваться вместо планшетов с матричным покрытием базальной мембраны и поддерживающей среды hiPSC (mTeSR1). Для приготовления 12-луночных планшетов, покрытых витронектином, разбавляют витронектин разбавляющим буфером до конечной концентрации 10 мкг/мл, а затем переносят по 500 мкл разбавленного раствора в каждую лунку 12-луночных планшетов. Оставьте пластины при температуре 20-25 °C не менее чем на 1 час. Плотность посева сингуляризованных ИПСК сопоставима с плотностью, используемой для пластин с покрытием из матрицы базальной мембраны. Изменение питательной среды или состава матрицы может повлиять на пролиферацию и спонтанную дифференцировку ИПСК, которым обычно требуется 1-2 недели для адаптации к новым условиям культивирования. Если для поддержания hiPSC используется более стабильная поддерживающая среда hiPSC, эта среда может быть использована для дифференциации EPC вместо поддерживающей среды hiPSC. В этом случае более стабильная поддерживающая среда hiPSC должна быть заменена на День -2 для удаления ингибитора ROCK, а замену на День -1 можно пропустить.
