Методическая статья

Очистка клеток-предшественников эндотелия CD31+ с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Matsuo, K., et al. Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в микрососудистые эндотелиальные клетки, подобные клеткам головного мозга, со зрелым иммунным фенотипом. J. Vis. Exp. (2023).

Это видео демонстрирует технику очистки эндотелиальных клеток-предшественников CD31+ (EPC) из культуры с использованием магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS). Клеточная суспензия обрабатывается флуорофор-конъюгированным антителом, которое связывается с CD31 на ЭПК. Завершение мечения CD31+ EPC включает в себя добавление комплекса антител, который связывается с флуорофорами, и магнитной наночастицы с полимерным покрытием, которая связывается с комплексом антител. Затем меченые клетки очищают с помощью магнитного поля, отбрасывая любые CD31-клетки.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Линия индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC), HPS1006, была предоставлена RIKEN BRC через Национальный проект биоресурсов MEXT/AMED, Япония.

1. Индукция дифференцировки hiPSC в эндотелиальные клетки-предшественники (EPC)

  1. Планшеты и реагенты с покрытием из внеклеточного матрикса (ВКМ)
    1. Подготовьте 12-луночные планшеты с базальной мембраной, покрытые матрицей, путем выделения 2,5 мг матричного геля в центрифужные пробирки объемом 50 мл для хранения при температуре -20 °C в течение 6 месяцев. Добавьте в пробирку 30 мл холодной модифицированной Dulbecco смеси среды/питательных веществ F-12 (DMEM/F12), которая хранилась в холодильнике (4 °C). Осторожно перемешайте с помощью пипетирования, пока гель не оттает, а затем добавьте по 500 мкл раствора в каждую лунку 12-луночного планшета. Поместите планшет в инкубатор (37 °C, 5%CO2) не менее чем на 1 ч.<бр/> заметка: Матричный гель базальной мембраны чувствителен к температуре, и с ним следует обращаться в соответствии с инструкциями производителя по аликвотированию и покрытию пластин. Концентрация белков внеклеточного матрикса может варьироваться между партиями. Для обеспечения точности точная концентрация должна быть указана в сертификате качества для конкретной партии, используя номер партии. Например, если точная концентрация составляет 10,0 мг/мл, используйте 250 мкл геля, чтобы получить в общей сложности 2,5 мг.
    2. Готовьте стоковый раствор ингибитора рокиназы (ROCK) путем растворения ингибитора ROCK в стерильной воде до концентрации 10 мМ (табл. 1). Разбавьте исходный раствор объемом 100-200 мкл и храните при температуре -20 °С, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания.
    3. Приготовьте стоковый раствор L-аскорбиновой кислоты в концентрации 100 мг/мл, растворив 5 г L-аскорбиновой кислоты в 50 мл стерильной воды, и храните при температуре -20 °C (Таблица 1). Добавьте 6,25 мл глутамина и 305 мл исходного раствора L-аскорбиновой кислоты в 500 мл усовершенствованного DMEM/F12 для получения среды LaSR (Таблица 1). Хранить при температуре 2-8 °C до 2 недель.
    4. Приготовьте CHIR99021 раствор, растворив CHIR99021 в неразбавленном диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации 10 мМ (табл. 1). Разложите раствор по 100-200 μл объемов, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания, и храните при температуре -20 °C до 1 года. Хранить рабочие аликвоты стокового раствора при температуре 4 °С до 1 месяца.
    5. Приготовьте среду DMEM/F12-10, добавив 50 мл инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки к 450 мл DMEM/F12. Хранить среду при температуре 2-8 °C до 1 месяца (Таблица 1).
    6. Приготовьте проточный буфер-1 путем добавления 33,3 мл 7,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) к 467 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) Дульбекко (Таблица 1). Хранить при температуре 2-8 °C до 6 месяцев.
  2. Посев сингуляризованных ИПСК и расширение для дифференцировки ЭПК (день -3 по день -1)
    1. Дифференцировку начинают, когда колонии hiPSC в 6-луночном планшете не демонстрируют спонтанной дифференцировки и имеют соответствующую плотность для пассирования, обычно около 80% конфлюенции (2,5-3,5 x 106 клеток). Внимательно наблюдайте за спонтанно дифференцированными клетками под микроскопом, чтобы убедиться, что для элиминации недифференцированных клеток требуются множественные пассажи. Обратитесь к приведенному ниже примечанию к шагу 1.4.15 для получения информации о среде для культивирования клеток и внеклеточном матриксе.
    2. Отсадите среду и добавьте в лунки 1 мл диссоциационного реагента и инкубируйте в течение 5-7 мин при 37 °C. Диссоциируйте и разделите клетки, осторожно нанеся раствор диссоциационного реагента пипетированием на поверхность лунок два или три раза.
    3. Перенесите отделенные клетки в пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл поддерживающей среды hiPSC, и тщательно ресуспендируйте клетки. Зарезервируйте аликвоту 10 мкл для подсчета клеток.
    4. Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение 5 мин при 200 x g при 20-25 °C. Подсчитайте ячейки и рассчитайте необходимый объем для достижения соответствующей плотности ИПСК (75-400 x 103 на лунку) в 12-луночном планшете, покрытом базальной мембраной (шаг 1.1.1).
    5. Отсадите раствор покрытия из лунок и добавьте в каждую лунку 1 мл среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK (разведение 1:1000). После центрифугирования аспирировать надосадочную жидкость и диссоциировать гранулу в 1 мл среды hiPSC.
    6. Добавьте необходимый объем ИПСХ, определенный на шаге 1.2.4, в каждую лунку 12-луночного планшета. От двух до четырех 12-луночных планшетов может быть достаточно для дифференциации клона hiPSC. Обратитесь к шагу 1.2.4 для определения количества пластин, необходимых для засева ячеек.
    7. Поместите планшет в инкубатор (37 °C, 5%CO2). Равномерно распределите ячейки, осторожно перемещая пластину вперед и назад, а затем из стороны в сторону в инкубаторе.
    8. На следующий день (т.е. на день -2) замените среду на 2 мл поддерживающей среды hiPSC, в которой отсутствует ингибитор ROCK. На следующий день (День -1) замените среду на 2 мл свежей поддерживающей среды hiPSC.
  3. Индукция ЭПК ингибитором гликогенсинтазы киназы 3 (GSK-3) CHIR99021 (день 0 - день 5)
    1. В день 0 замените поддерживающую среду hiPSC в каждой лунке 2 мл среды LaSR, содержащей 8 мкМ CHIR99021.
    2. В 1-й день аспирируйте среду и добавьте 2 мл свежей среды LaSR, содержащей 8 мкМ CHIR99021.
    3. На 2, 3 и 4 дни замените среду 2 мл свежей среды LaSR, которой не хватает CHIR99021.
  4. Магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS) для очистки CD31+ EPC (день 5)
    1. На 5-й день аспирируйте среду, а затем добавьте по 1 мл диссоциационного реагента в каждую лунку перед инкубацией в течение 6-8 мин при 37 °C.
    2. Диссоциируйте и разделите клетки с помощью микропипетки и пропустите через клеточный фильтр размером 40 мкм для фильтрации суспензии в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл среды DMEM/F12-10. Клеточную суспензию, собранную из более чем двух 12-луночных планшетов, отфильтровать по меньшей мере в две пробирки объемом 50 мл.
    3. Остановите реакцию пищеварения, добавив среду DMEM/F12-10 (до 50 мл). Тщательно пипетируйте и оставьте 10 мкл для подсчета ячеек. Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение 5 минут при 200 x g при 20-25 °C.
    4. После удаления надосадочной жидкости добавьте 10 мл среды DMEM/F12-10 и переложите клеточную суспензию в свежие пробирки объемом 15 мл. Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение 5 минут при 200 x g при 20-25 °C.
    5. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте в буфер потока-1 с плотностью 1,0 х 10 7 клеток на 100 мкл буфера.
    6. Добавьте реагент, блокирующий Fc-рецептор (FcR) в соотношении 1:100 и инкубируйте в течение 5 минут перед добавлением меченного флуоресцеином изотиоцианата (FITC) антитела CD31, разбавленного в соотношении 1:200. Выдержать суспензию в течение 30 минут в темноте при температуре 20-25 °С.
    7. Добавьте 10 мл проточного буфера-1, зарезервировав 10 мкл суспензии для анализа проточной цитометрии для определения фракции CD31+ клеток (рис. 1).
    8. Гранулируйте клетки центрифугированием при 200 x g в течение 5 минут при 20-25 °C. Затем удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют до плотности 1,0 х 107 клеток на 100 мкл проточного буфера-1 раствора. Добавьте отборочный коктейль FITC (5 μл на 100 μл клеточной суспензии). Тщательно перемешать пипеткой и выдерживать в темноте 15 минут при температуре 20-25 °C.
    9. Добавьте 5 мкл магнитных наночастиц на 100 мкл клеточной суспензии, хорошо пипетируйте и инкубируйте в темноте в течение 10 мин при 20-25 °С.
    10. Перенесите клеточную суспензию в пробирку для проточной цитометрии объемом 5 мл и добавьте проточный буфер-1 для достижения общего объема 2,5 мл. Поместите пробирку проточной цитометрии в магнит на 5 минут.
    11. Непрерывным движением инвертируйте магнит и сцеживайте клеточную суспензию, содержащую клетки, которые не были помечены антителом FITC-CD31. Удерживайте магнит и трубку в перевернутом положении в течение 2-3 с, а затем удалите остатки жидкости. Отсадите все капли с края трубки, прежде чем вернуть трубку в вертикальное положение.
    12. Возьмите пробирку проточной цитометрии из магнита и добавьте 2,5 мл проточного буфера-1 для промывания оставшихся клеток CD31+. Ресуспендируйте клетки, осторожно пипетируя клетки вверх и вниз два или три раза. Поместите проточную трубку в магнит на 5 минут.
    13. Повторите шаги 1.4.11-1.4.12 три раза, а затем шаг 1.4.11 еще раз, всего четыре стирки.
    14. Снимите проточную трубку с магнита и добавьте указанное количество подходящей среды (например, среды, не содержащей эндотелиальной сыворотки крови человека [hECSR] для расширенного культивирования EC или замораживающей среды для замораживания) в трубку для ресуспендирования очищенных CD31+ клеток. Резервируйте две аликвоты суспензии по 10 мкл, одну для подсчета клеток, а вторую для проведения анализа проточной цитометрии с целью оценки чистоты клеток CD31+ в образцах после MACS (рис. 1). Если проточный цитометр недоступен немедленно, храните аликвоту при температуре 4 °C до анализа.
    15. Заморозьте CD31+ EPC на этом этапе.
      заметка: 12-луночные планшеты с покрытием из витронектина и более стабильная поддерживающая среда hiPSC (mTeSR plus) могут использоваться вместо планшетов с матричным покрытием базальной мембраны и поддерживающей среды hiPSC (mTeSR1). Для приготовления 12-луночных планшетов, покрытых витронектином, разбавляют витронектин разбавляющим буфером до конечной концентрации 10 мкг/мл, а затем переносят по 500 мкл разбавленного раствора в каждую лунку 12-луночных планшетов. Оставьте пластины при температуре 20-25 °C не менее чем на 1 час. Плотность посева сингуляризованных ИПСК сопоставима с плотностью, используемой для пластин с покрытием из матрицы базальной мембраны. Изменение питательной среды или состава матрицы может повлиять на пролиферацию и спонтанную дифференцировку ИПСК, которым обычно требуется 1-2 недели для адаптации к новым условиям культивирования. Если для поддержания hiPSC используется более стабильная поддерживающая среда hiPSC, эта среда может быть использована для дифференциации EPC вместо поддерживающей среды hiPSC. В этом случае более стабильная поддерживающая среда hiPSC должна быть заменена на День -2 для удаления ингибитора ROCK, а замену на День -1 можно пропустить.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Таблица 1: Подробная информация о конкретных реагентах для анализов. Описывается название и точное количество ингредиентов для каждого конкретного реактива.

Специфический реагентингредиенттом
Уксусная кислота, 0,5 мг/мл растворуксусная кислота<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 мм Шприцевой фильтр ТЭС 99722
15 мл Центрифужная пробирка сокол 352196
Сетчатый фильтр Falcon Cell 40 мкм сокол 352340 (Английский
5 мл Туба с круглым дном уровень звукового давления 40005
50 мл Центрифужная пробирка сокол No 352070 (Английский
Планшет на 96 лунок, круглое дно уровень звукового давления No 34096 (Английский
АккутазаСигма-ОлдричА6964-500мл
уксусная кислота Сигма-Олдрич 695092
Усовершенствованный DMEM/F12 Технологии Life No 12634
Флуоресцентный микроскоп «все в одном» Кейенс БЗ-Х810
Добавка B-27 (503), без сыворотки Thermo Fischer Scientific 17504044
Бычий сывороточный альбумин (БСА), 7,5% в дPBSСигма-Олдрич А8412
Буфер для разбавления CellStick Технологии стволовых клетокСТ-07183
CHIR99021Селлек КемикалсС1263
Коллаген внутривенно из плаценты человекаСигма-ОлдричС5533
Планшеты для культивирования тканей Corning (12-луночные)КорнингNo 3512
Планшеты для культивирования тканей Corning (6-луночные)КорнингNo 3506
Внутренняя крышка криопробирки 2,0 млУотсон1396-201С
Диметилсульфоксид (ДМСО), стерильныйСигма-ОлдричД2650
DMEM (13), [+] 4,5 г/л D-глюкозы, [-] L-глутамин, [-] пируватThermo Fischer Scientific31053-028 (Английский)
PBS Дульбекко (d) PBS (без кальция, магния)Термо Фишер14190250
Модифицированная смесь Дульбекко F-12 (DMEM-F12)Thermo Fischer Scientific11320074
Набор для положительного отбора EasySepFITC IIТехнологии стволовых клеток18558 г
Магнит EasySepMagnetТехнологии стволовых клеток18000
Этилендиаминтетрауксусная кислота раствор0,02% в DPBSсигмаЕ8008-100МЛ
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, квалифицированнаяThermo Fischer Scientific10270106
Буферный раствор HEPESThermo Fischer Scientific15630-056
Свободная среда эндотелиальной сыворотки человека (hESFM)Thermo Fischer Scientific11111-044 (Английский)
Фактор роста фибробластов человека 2 (FGF2)Токрис233-ФБ-500
iPS индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человекаRiken RBCHPS1006
Канамицина сульфат (100x)Thermo Fischer Scientific15160-047
L-аскорбиновая кислота 2-фосфат сесквимагния соль гидратСигма-ОлдричА8960-5G
L-глютамин 200 мМ (1003)Thermo Fischer Scientific25030-024 (Английский)
Матригель, сниженный фактор ростаКорнинг354230 (Английский
MEM NEAA (1003)Thermo Fischer Scientific11140-035 (Английский)
Ингибитор ROCK Y-27632Токрис1254
База RPMI medium 1640 TrisСигма-Олдрич93362
Тритон Х-100Сигма-ОлдричХ100
) ) ) . ) г.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD31 Positive CellsEndothelial Progenitor CellsMagnetic Activated Cell SortingFluorophore Conjugated AntibodyPolymer Coated Magnetic NanoparticlesFlow Cytometry AnalysisCell Surface MarkerCell Isolation TechniqueStem Cell DifferentiationCell Purification Method

Похожие статьи