$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка исходной среды и восстановление стволовых клеток
- Приготовьте запас питательной среды (DFHGPS), объединив реагенты на этапах 1.1.1.-1.1.5.
- Добавьте 210 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco с высоким содержанием глюкозы и L-глутамина (D). Хранить при температуре 4 °C.
- Добавьте 70 мл питательной смеси Ham's F12 с добавкой L-глютамина (F). Хранить при температуре 4 °C.
- Добавьте 4,2 мл 15 мл буфера HEPES (H) и храните его при комнатной температуре.
- Добавьте 4,2 мл 10% раствора D-глюкозы (G) и храните при комнатной температуре.
- Добавьте 2,88 мл раствора пенициллина/стрептомицина (ПС). Разложите исходный раствор на 3 мл и храните аликвоты при температуре -20 °C до тех пор, пока они не понадобятся.<бр/>
заметка: Конечная концентрация пенициллина в среде составит 100 ед/мл, а концентрация стрептомицина – 100 мкг/мл. Эта среда будет называться DFHGPS до конца протокола и должна храниться при температуре 4 °C для использования в течение 1-2 недель. При необходимости DFHGPS может быть пропорционально увеличен.
- За день до восстановления клеток обмажьте колбу Т75 5 мл кондиционированной среды, полученной из предыдущих культур клеточной линии hNSC, и оставьте ее на ночь в инкубаторе с температурой 37 °C с 8,5% углекислым газом (CO2).
заметка: Если вы в настоящее время культивируете hNSC, сохраните среду, в которой клетки росли во время смены среды. Это кондиционированная среда, поскольку она была «кондиционирована» клетками. Кондиционированную среду можно сохранить в пробирке с завинчивающейся крышкой и хранить при температуре 4 °C в течение примерно 7 дней. Свяжитесь с автором-корреспондентом для получения hNSC. Кондиционированная среда предпочтительна, но не является абсолютно необходимой, особенно при первом посеве НЦК.
- В день выздоровления нагрейте 20 мл DFHGPS в пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 50 мл на водяной бане при температуре 37 °C в течение не менее 10 минут и держите на водяной бане до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.
- В отдельной пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл нагрейте 10 мл DFHGPS на водяной бане при температуре 37 °C в течение не менее 10 минут и держите его на водяной бане до готовности к использованию на шаге 1.13.
- Достаньте контейнер со льдом и всеми компонентами среды (Таблица 1). Разморозьте все компоненты среды на льду и оставьте их на льду во время подготовки к смене среды.
- Возьмите 5 мл кондиционированной среды (храните при 4 °C) и держите ее на водяной бане при температуре 37 °C до готовности к использованию на шаге 1.14. Смотрите примечание после шага 1.2, если не существует кондиционированной среды или современной культуры нейральных стволовых клеток плода человека.
- Извлеките пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 50 мл из шага 1.3 и поместите ее в шкаф биобезопасности (BSC). Перелейте 10 мл DFHGPS в новую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл, а затем поместите 50 мл пробирки, содержащей оставшиеся 10 мл среды DFHGPS, обратно в водяную баню при температуре 37 °C.
- Получить криофлакон с гНСК, хранящимися в жидком азоте. Смотрите примечание после шага 1.2, если в настоящее время не существует культуры нейральных стволовых клеток человеческого плода.
заметка: Нервные стволовые клетки человека первоначально были получены из выброшенного мозга человеческого плода12 и сохранены в культуре без генетических модификаций10. 5 × 106 элементов следует разморозить и покрыть на колбе Т75. Каждый криофлакон должен содержать 5 × 10,6 клеток; Поэтому нужен один флакон на колбу.
- Разморозьте флакон с ячейками на водяной бане при температуре 37 °C, переворачивая флакон каждые 10 с в течение примерно 1 минуты или до тех пор, пока лед не растает и содержимое флакона не станет полностью жидким. Не погружайте весь флакон под воду, чтобы избежать возможного загрязнения.
- В BSC используйте микропипетку P1000 для аспирации раствора размороженных клеток и добавьте его по каплям в пробирку объемом 15 мл с шага 1.7, содержащую 10 мл DFHGPS. Чтобы добавить раствор размороженной ячейки по каплям, медленно надавливайте на поршень так, чтобы сразу выделилась только одна или две капли. Тем временем покрутите пробирку объемом 15 мл, чтобы обеспечить быстрое смешивание.
- Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, убедившись, что клетка сохранилась.
- Во время шага 1.11 извлеките 50 мл пробирки, содержащей оставшиеся 10 мл из шага 1.7. После центрифугирования повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл DFHGPS и снова центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Во время заключительного отжима приготовьте новую питательную среду, следуя таблице 1, чтобы добавить факторы роста к 10 мл среды DFHGPS из стадии 1.4 (Таблица 1) в BSC. Оставьте новую среду, содержащую факторы роста в ССК, до тех пор, пока она не будет готова к использованию.
- Извлеките колбу T75 из шага 1.2 и выбросьте кондиционированную среду, покрыв колбу аспирацией. Затем добавьте 5 мл кондиционированной среды из шага 1.6. к колбе с помощью серологической пипетки. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать дно колбы.
- Извлеките пробирку с клетками из центрифуги и выбросьте надосадочную жидкость, аспирировав ее, оставив клеточную гранулу нетронутой.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл новой среды с шага 1.13 с помощью серологической пипетки объемом 5 мл и несколько раз пипетируя вверх и вниз. Добавьте подвеску в колбу T75 с покрытием из шага 1.14. Используйте оставшиеся 5 мл для промывки пробирки, в которой содержалась клеточная гранула, а затем добавьте эти 5 мл в колбу.
- Покачайте колбу T75 вперед и назад 3 раза, чтобы убедиться, что ячейки равномерно распределены по колбе. Убедитесь, что крышка колбы ослаблена, чтобы обеспечить приток воздуха. Под световым микроскопом наблюдайте за клетками, делайте заметки и, если возможно, делайте снимки.
заметка: Ячейки должны выглядеть полупрозрачными и сферическими. Обратите внимание, если клетки выглядят темными, непрозрачными или имеют асимметричные границы, так как это может указывать на гибель клеток. Кроме того, следите за грибковым или бактериальным загрязнением, например, за тем, что среда приобретает желтый цвет.
- Поместите колбу с ячейками в инкубатор при температуре 37 °C с 8,5% CO2,
заметка: Используйте 8,5% вместо 5,0%CO2 для поддержания pH этой бессывороточной питательной среды в диапазоне 7,1-7,4.
2. Изменение среды hNSC
ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте носитель каждые 3-4 дня.
- Включите BSC и тщательно очистите от него 70% этанолом. Наблюдайте за клетками под световым микроскопом.
заметка: Делайте заметки о внешнем виде ячеек и размерах сфер. Через три дня после выздоровления или пассажа клетки группируются вместе и начинают формировать неадгезивные нейросферы><.
осторожность: Если клетки прилипают ко дну колбы, культуру необходимо выбросить, так как адгезия клеток увеличит преждевременную дифференцировку, и клетки не смогут поддерживать стволовое состояние. Если клеток в колбе слишком много, клетки могут образовывать большие сферы (более 2 мм в диаметре), в этом случае клетки в центре сферы начнут дифференцироваться из-за отсутствия доступа к факторам роста в среде. Если наблюдаются сферы размером более 1 мм в диаметре, клетки можно пропускать (шаги 3.1-3.22).
- Следуйте шагам 1.4 и 1.5 и приготовьте 10 мл свежей среды (см. шаг 1.13).
- Наклоните колбу в сторону, позволяя сферам опуститься на дно колбы.
- Удалите 5 мл кондиционированной среды с верхней части объединенной среды с помощью серологической пипетки объемом 5 мл, стараясь не допустить аспирации нейросфер. Поместите 5 мл кондиционированной среды в чистую пробирку объемом 15 мл.
- Извлеките из колбы еще 5 мл кондиционированной среды, опять же осторожно избегая сфер, и поместите 5 мл в ту же 15 мл пробирку.
- Добавьте 10 мл новой среды, начиная с шага 2.2, к оставшимся 5 мл кондиционированной среды и клеток в колбе. Поставьте колбу на плоскую поверхность и наблюдайте за клетками под световым микроскопом.
- Если кажется, что клетки были аспирированы во время сбора кондиционированной среды, вращайте кондиционированную среду при 100 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторно суспендируйте все клетки, которые накапливаются на дне, в 1 мл кондиционированной среды, а затем добавьте их в колбу для культур.
- Храните 10 мл неиспользованной кондиционированной среды из этапов 2,5/2,6 при температуре 4 °C в пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл.
- Повторите шаги 1.17/1.18.
3. Проход hNSC
- Если вы расширяете NSC в новую колбу, убедитесь, что все новые колбы покрыты, как показано в шаге 1.2.
- Очистите ССП, как показано в шаге 2.1, и выполните шаги 1.4 и 1.5.
- Приготовьте среду, как в шаге 1.13. На каждую колбу T75 требуется 10 мл среды. Для нескольких колб T75 умножьте 10 мл среды на количество колб.
- Приготовьте 1 или 3 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (dPBS) и глюкозы и поместите на водяную баню при температуре 37 °C для нагревания на 10 минут (для раствора трипсина) в соответствии с объемами, указанными в таблице 2. В это время не добавляйте трипсин или ДНКазу. ДНКаза может потребоваться для разрушения любой ДНК, высвобожденной из мертвых клеток в результате механической или химической диссоциации клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: На одну колбу Т75, пропущенную после 9-10 дней роста, будет примерно 30 × 106 клеток, если 5 × 106 были первоначально посеяны в колбу. Как правило, 1 мл раствора dPBS используется для 10 × 106 клеток. Поэтому для колбы T75, проходимой через 9-10 дней, необходимо 3 мл раствора dPBS.
- Поместите чистую лодку для взвешивания и гемоцитометр в капот. Очистите 70% этанолом и дайте высохнуть на воздухе в вытяжке в течение примерно 5 мин.<бр/>
заметка: Весовой катер будет использоваться на этапах 3.17.1.
- Достаньте колбу с ячейками, которые будут выведены из инкубатора и внесены в БСК. Осторожно наклоните колбу, позволяя ячейкам опуститься на дно скопившейся среды. В колбе содержится около 15 мл среды.
- Удалите около 10 мл среды порциями по 5 мл (т. е. 5 мл + 5 мл). Поместите эти 10 мл среды в чистую пробирку объемом 15 мл с маркировкой «CM» для «кондиционированной среды». Будьте осторожны, чтобы не аспирировать ни одну из клеток, осевших в оставшихся 5 мл среды в колбе; эти клетки и 5 мл среды будут подвергнуты этапу 3.8.
- Возьмите 3 мл кондиционированной среды из пробирки «CM» (из шага 3.7) и поместите в пробирку объемом 15 мл с надписью «раствор ингибитора трипсина». Это будет использоваться на шаге 3.12. После удаления 3 мл в пробирке «СМ» остается 7 мл кондиционированной среды. Отложите трубку "CM" в сторону до шага 3.9.
- Удалите 5 мл среды и клеток, оставшихся в колбе T75, и поместите в чистую пробирку объемом 15 мл с маркировкой «Cells».
- Возьмите пробирку «CM», содержащую 7 мл кондиционированной среды (из шага 3.7.1), и дважды промойте дно колбы T75 порциями 3,5 мл кондиционированной среды с помощью серологической пипетки объемом 5 мл. После каждого полоскания помещайте порции объемом 3,5 мл в пробирку «Клетки». Целью этого шага является удаление всех нейросфер (клеток) из колбы Т75.
- Центрифугируйте пробирку "Cells" при давлении 100 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Пока клетки вращаются, получите раствор dPBS/глюкозы на водяной бане при температуре 37 °C и добавьте соответствующее количество трипсина и ДНКазы в соответствии с таблицей 2.
- После того, как пробирка "Cells" перестанет вращаться, удалите всю кондиционированную среду надосадочной жидкости и переложите в пробирку "CM".
- Возьмите пробирку с надписью «раствор ингибитора трипсина» из шага 3.7.1 и добавьте объем ингибитора трипсина, указанный в таблице 3. Используйте тот же объем раствора ингибитора трипсина, который использовался для раствора трипсина.
- Поместите раствор ингибитора трипсина на водяную баню при температуре 37 °C до тех пор, пока это не понадобится.
- Добавьте раствор трипсина в клеточную гранулу в пробирке объемом 15 мл и делайте пипетку вверх и вниз примерно 5-10 раз с помощью пипетки объемом 5 мл. Закройте крышку пробирки и выдерживайте на водяной бане при температуре 37 °C в течение 5 минут. Через 5 минут извлекайте клетки и пипетку вверх и вниз 5-10 раз. Затем инкубируйте на водяной бане при температуре 37 °C еще 10-15 минут.
- В последние 5 минут переместите раствор ингибитора трипсина в BSC.
- Извлеките клетки после завершения шага 2.14 и пипетируйте клетки вверх и вниз до тех пор, пока сферы полностью не диссоциируют (20-30 раз). Затем сразу же добавьте раствор ингибитора трипсина и пипетку вверх и вниз 10 раз. Этот раствор диссоциированных клеток и ингибитора трипсина будет называться «клеточной суспензией».
- Подсчитайте количество клеток в клеточной суспензии, выполнив следующие действия.
- Нанесите пипеткой 15 мкл предварительной смеси Trypan Blue (содержащей 5 мкл 0,4% Trypan Blue и 10 мкл dPBS) на небольшую весовую лодку, а затем добавьте 5 мкл клеточной суспензии. Пипеткой вверх и вниз 3-5 раз перемешайте. Затем нанесите пипетку объемом 10 мкл суспензии Trypan Blue/cell на обе стороны гемоцитометра, покрытого стеклянным покровным стеклом.
- Понаблюдайте за клетками под световым микроскопом и подсчитайте общее количество клеток в каждой из четырех угловых сеток. Сложите эти цифры вместе.
- Повторите подсчет для другой стороны и усредните две стороны вместе.
- Умножьте это число на 10 000, чтобы получить общее количество клеток на мл. Умножьте это число на общее количество миллилитров, чтобы рассчитать общее количество клеток в клеточной суспензии. Рассчитайте, какой объем клеточной суспензии потребуется для посева 5 миллионов клеток в колбе T75.
заметка: Как правило, через 9-10 дней у Т75 будет 25-30 × 106 клеток. Поэтому, если пропускать все клетки в новые колбы, всего потребуется 5-6 колб.
- Добавьте объем клеточной суспензии, рассчитанный на шаге 3.19, в каждую колбу Т75, чтобы получить 5 × 106 клеток на колбу. Если объем меньше 5 мл, добавьте дополнительную кондиционную среду, чтобы в сумме получилось до 5 мл. Затем добавьте в колбу 10 мл новой среды DFHGFPS, содержащей факторы роста (табл. 1).
- Повторите шаги 1.17 и 1.18 и убедитесь, что на колбе указан тип ячеек, даты, количество ячеек в колбе и номер прохода (это количество раз, когда ячейка была пройдена). Затем перейдите к шагу 4.
- При необходимости высейте дополнительные ячейки в одну колбу Т75 плотностью до 30 ×10-6 ячеек в колбе на ночь и заморозьте на следующий день в соответствии с Шагом 4.
4. Замораживание и хранение hNSC
- На следующий день после пассажа достаньте колбу из инкубатора, содержащего клетки, для заморозки (из шагов 3.19 и 3.22). Наклоните колбу и удалите из колбы всю среду и клетки, а затем поместите в пробирку объемом 15 мл. Затем центрифугируйте пробирку при давлении 216 x g в течение 5 минут.
- В процессе центрифугирования подготовьте замораживающую среду (табл. 4). На каждые 5 × 106 клеток готовят по 1 мл замораживающей среды. Количество ячеек определяли на шаге 3.19 при определении того, сколько ячеек следует поместить в каждую колбу. Это число не изменится за одну ночь.
- Подготовьте флаконы для криоконсервации с этикетками с названием ячейки, номером прохода, номером ячейки, инициалами и датой. После центрифугирования надосадочную жидкость удалить с помощью аспирации и повторно суспендировать клеточную гранулу в замораживающей среде так, чтобы было 5 × 106 клеток/мл. С помощью пипетки объемом 5 мл нанесите 1 мл на флакон и плотно закупорьте (5 × 106 клеток во флаконе).
- Поместите флаконы в контейнер для криоконсервации с 250 мл изопропанола (максимальное использование — 5 раз на замену изопропанола). Хранить в морозильной камере при температуре -80 °C на ночь, а затем переложить в систему хранения жидкого азота.
5. Покрытие адгезивного hNSC для валидации
- За день до прохода (шаги 3.1-3.22) очистите БСК, как описано в шаге 2.2, и получите 24-луночный планшет и стерильное стекло 12 мм покровных стекол.
- С помощью щипцов поместите один покровный лист на дно каждой лунки пластины.
- Покройте лунки, содержащие покровные стекла, 0,01% поли-D-лизином (PDL) в стерильной воде и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C. Для 24-луночного планшета используйте 250 μL PDL на лунку.
- Удалите PDL из лунок, а затем покройте его 1 мкг/см2 ламинина/дPBS (250 мкл на лунку). Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 °C. Если на следующий день в этом нет необходимости, запечатайте пластину парапленкой, обернув ее по краям, и храните при температуре 4 °C.
заметка: Пластины, покрытые ламинином, могут храниться до 2 недель, если они запечатаны парапленкой, до тех пор, пока покровные стекла не высыхают.
- Пройдите ячейки, как описано в шагах 3.1-3.22, а затем определите количество клеток для посева в 24-луночный планшет с покрытием.
- Удалите избыток раствора ламинина из лунок с помощью аспирации и промойте один раз 0,5 мл dPBS. Затем затравливают клетки в лунки плотностью 0,6-1 х 10по 5 клеток/см2 на лунку. Используйте все оставшиеся ячейки в соответствии с шагами 3.16-3.21.
- В разное время во время культивирования 24-луночных планшетов фиксируйте и окрашивайте клетки для получения различных маркеров стволовых клеток.