$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Генерация агрегатов iPSC
- Получение одноклеточных монослойных культур из колоний iPSC
- Приготовьте экстракт базальной мембраны (BME), покрытый 6-луночным планшетом. Разморозьте BME на льду при 4 °C в течение 2-3 часов, разбавьте его холодным Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12; разведение 1:50), залейте пластину 1 мл/лунку разбавленным раствором BME и храните пластину в течение ночи при температуре 4 °C.
- Отсадите среду и промойте интактные колонии иПСК не менее двух лунок 6-луночного планшета 0,5 мМ ЭДТА в фосфатно-солевом буфере (PBS) дважды перед инкубацией колоний 0,5 мМ этилендиаминететрауксусной кислотой (ЭДТА) в PBS в течение 4 мин при комнатной температуре (RT). Отсадите раствор ЭДТА и аккуратно отделите колонии, смыв их со дна чашки 5 мл среды DMEM-F12. Соберите их в пробирку объемом 15 мл и гранулируйте центрифугированием (4 мин при 1200 x g при RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК перепрограммированы из коммерчески доступных фибробластов, были успешно использованы.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и инкубируйте колонии иПСК с 500 мкл реагента для диссоциации клеток в течение 6 мин при 37 °C.
- Осторожно пипетируйте клеточную суспензию несколько раз вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1 мл, чтобы разбить оставшиеся клеточные кластеры на отдельные клетки.
- Добавьте 4 мл DMEM-F12 в клеточную суспензию, чтобы разбавить реагент для диссоциации клеток.
- Вращайте ячейки при давлении 1 200 x g в течение 4 минут при RT.
- Ресуспендируйте клетки в 2 мл iPSC-среды с добавлением 5 μM Y-27632 и затравочных клеток в одну лунку 6-луночного планшета с BME-покрытием.
заметка: Используйте среду iPSC, указанную в Таблице материалов, для одноклеточных монослойных iPSC-культур.
- На следующий день замените среду на свежую среду iPSC, в которой отсутствует Y-27632. С этого момента продолжайте культивировать клетки, меняя среду каждый день до тех пор, пока иПСК не станут на 100% слитыми. В зависимости от клеточной линии и слияния стартовых лунок, это займет от 2 до 4 дней.
- После слияния пройдите через iPSCs. Аспирируйте среду и нанесите на клетки 500 μл реагента для диссоциации клеток.
- Инкубируйте клетки в течение 5-10 минут при температуре 37 °C. Осторожно покачивайте пластину, чтобы отделить ячейки.
- Промойте клетки из лунки с помощью 2 мл DMEM-F12 и соберите их в пробирку объемом 15 мл. Добавьте DMEM-F12 в общем объеме 5 мл.
- Раскрутите клетки при давлении 1200 x g в течение 4 минут в режиме RT и аспирируйте надосадочную жидкость.
- Засемените клетки в среде iPSC с добавлением 5 μM Y-27632 в соотношении от 1:2 до 1:4 на 6-луночном планшете с BME-покрытием (2 мл/лунка среды).
- Продолжайте культивировать клетки в течение 2-5 дней и ежедневно меняйте среду iPSC, в которой отсутствует Y-27632. После слияния проходят iPSC (шаги 1.1.4-1.1.8).
заметка: Культивируйте иПСК в течение не менее 2 пассажей в качестве монослоя в среде иПСК, указанной в Таблице материалов, прежде чем использовать их для получения агрегатов ИПСК для того, чтобы позволить клеткам адаптироваться к условиям культивирования.
- Используйте монослойные культуры iPSC, когда они на 70-90% сливаются для получения агрегатов iPSC.
ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК адаптирован к условиям культивирования, так как отдельные клетки менее подвержены стрессу, который приводит к гибели клеток во время процедуры диссоциации и агрегации. Монослойные культуры iPSC должны демонстрировать типичную плюрипотентную морфологию без признаков дифференцировки. Регулярно проверяйте культуры на контаминацию микоплазмами. Работайте только с культурами iPSC, не содержащими микоплазмы.
- Отсадите питательную среду из одной лунки 6-луночного планшета и нанесите на клетки 500 мкл реагента для диссоциации клеток.
- Инкубируйте клетки в течение 5-10 минут при температуре 37 °C. Осторожно покачивайте пластину, чтобы отделить ячейки.
- Промойте ячейки из лунки с помощью 2 мл DMEM-F12 и соберите их в пробирку объемом 15 мл. Добавьте DMEM-F12 в общем объеме 10 мл.
- Для подсчета клеток возьмите 25 μL из клеточной суспензии и смешайте его с 25 μL трипанового синего цвета, чтобы пометить мертвые клетки. Подсчитайте живые клетки с помощью счетной камеры.
- Соберите достаточное количество клеток (4500 клеток на агрегат iPSC) из клеточной суспензии в пробирку объемом 15 мл.
- Раскрутите клетки при давлении 1200 x g в течение 4 минут в режиме RT и аспирируйте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме iPSC-среды с добавлением 50 μM Y-27632 для получения 4500 живых клеток на 150 μL.
заметка: Использование высокой концентрации Y-27632 (50 мкМ) имеет решающее значение для выживания иПСК.
- Поместите 150 мкл в каждую лунку 96-луночной U-образной нижней пластины с низким уровнем крепления и поместите ее в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2,
заметка: При создании агрегатов iPSC учитывайте, что на 20-й день для контроля качества требуется не менее 6 органоидов (см. раздел 5).
2. Индукция передней нейроэктодермы
- Внимательно отслеживайте морфологические изменения агрегатов iPSC каждый день под микроскопом тканевой культуры с помощью линзы с 4-кратной или 10-кратной мощностью. Наблюдайте в 1-й день, клеточные агрегаты с четкими границами. Продолжайте культивировать агрегаты iPSC в инкубаторе при температуре 37 °C и 5% CO2,
заметка: Определенное количество мертвых клеток/колодцев является нормальным и не влияет на генерацию органоидов.
- Подавайте агрегаты iPSC, начиная со 2-го дня и продолжая через день, осторожно отсасывая примерно 2/3 среды, не нарушая клеточные агрегаты внизу. Добавьте еще 100 мкл iPSC среды, в которой отсутствует Y-27632.
заметка: В течение 4-6 дней агрегаты ячеек достигают диаметра 350-450 мкм и имеют гладкие края.
- На этом этапе объедините клеточные агрегаты с отрезанным наконечником пипетки объемом 100 мкл в чашку диаметром 6 см с низким уровнем крепления (максимум 20 агрегатов на чашку) в кортикальной индукционной среде, содержащей DMEM-F12 с добавкой N2 (1:200), добавкой B27 (1:100), глюкозой (0,2 мг/мл), циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ; 0,15 мкг/мл), 0,5% заменимых аминокислот (NEAA), 1% L-аланил-L-глутамин, гепарин (10 мкг/мл) и соединения LDN-193189 (180 нМ), A83-01 (500 нМ) и ингибитор Wnt-ответа-1 (IWR-1) (10 мкг/мл). Подкармливайте клеточные агрегаты, меняя кортикальную индукционную среду через 3 дня после переноса их в 6-сантиметровую посуду.
- Внимательно следите за морфологическими изменениями во время индукции коры головного мозга под микроскопом тканевой культуры с помощью объектива с 4-кратной мощностью.
заметка: Через 4-5 дней в корковой индукционной среде края клеточных агрегатов должны начать светлеть на поверхности, что свидетельствует о нейроэктодермальной дифференцировке. На этой стадии возникает радиальная организация псевдослоистого эпителия. Перейдите к разделу 3 для встраивания агрегатов ячеек в матрицу BME.
3. Встраивание нейроэктодермальных агрегатов в матричный каркас
- Разморозьте БМЭ на льду при 4 °С в течение 2-3 ч. Аликвота неразбавленного БМЭ в достаточном количестве.
- Подготовьте лист пластиковой парафиновой пленки для процедуры заделки. Разрежьте пластиковую парафиновую пленку стерильными ножницами на большие куски размером 4 см x 4 см, положите кусок пластиковой парафиновой пленки на пустой лоток для наконечников объемом 100 μл для наконечников объемом 100 μл и прижмите пальцем в перчатке, чтобы на листе пластиковой парафиновой пленки образовались небольшие ямочки (требуется 1 ямочка/ячеистый агрегат). Очистите пластиковую парафиновую пленку с 70% этанолом и облучите ее ультрафиолетовым излучением (мощность: 15 Вт, длина волны: 435 нм) под закрытой стерильной скамьей в течение 30 минут.
- Перенесите каждый агрегат ячеек на одну углубление листа пластиковой парафиновой пленки с помощью режущего наконечника объемом 100 мкл с отверстием диаметром 1,5-2 мм. В случае, если два агрегата ячеек срослись, не разделяйте их, а переносите вместе в одну ямочку.
- Осторожно отсасывайте среду, окружающую клеточные агрегаты, с помощью неразрезанного наконечника пипетки объемом 100 мкл.
заметка: Будьте осторожны, чтобы не засосать агрегаты клеток в наконечник, так как это может повредить агрегаты.
- Добавьте 40 μL неразбавленного BME в каждый клеточный агрегат.
- Расположите каждый агрегат ячеек в центре капли BME с помощью неразрезанного наконечника для дозатора объемом 100 мкл.
заметка: Будьте очень осторожны, чтобы не повредить развивающийся нейроэпителий наконечником пипетки.
- Осторожно перенесите лист пластиковой парафиновой пленки с помощью стерильных щипцов в чашку Петри диаметром 10 см (или другую чашку для клеточной культуры) и поместите чашку в инкубатор на 15-20 минут, чтобы дать БМИ застыть.
- Тем временем приготовьте чашку длиной 6 см с низким уровнем крепления, содержащую 5 мл кортикальной индукционной среды.
- После полимеризации БМЭ удалите капли, содержащие агрегаты клеток, с листа пластиковой парафиновой пленки. С помощью стерильных щипцов переверните пластиковую парафиновую пленку и аккуратно выдавите клеточные агрегаты в слегка наклоненную (около 30°) посуду с низким уровнем крепления 6 см до тех пор, пока капли не упадут с листа пластиковой парафиновой пленки. Переложите максимум 16 клеточных агрегатов в одну чашку диаметром 6 см.
- Продолжайте инкубацию клеточных агрегатов при температуре 37 °C.
4. Генерация органоидов переднего мозга из нейроэктодермальных агрегатов
- Через сутки после встраивания в матрицу BME поместите чашки для органоидных культур на качающийся шейкер для клеточных культур с углом наклона 5° и 14 об/мин, установленный в инкубаторе для клеточных культур.
- Контролируйте органоиды каждый день. Гомогенные нейроэпителиальные петлевые структуры постепенно развиваются после встраивания в матрицу БМЭ.
- Когда видны структуры нейроэпителиальной петли, замените среду на органоидную среду дифференцировки, содержащую DMEM-F12, с добавкой N2 (1:200), добавкой B27 (1:100), глюкозой (0,2 мг/мл), цАМФ (0,15 мкг/мл), 0,5% NEAA, 1% L-аланил-L-глутамина, инсулином (2,5 мкг/мл)
- Заменяйте органоидную среду для дифференцировки каждые 3-4 дня до тех пор, пока не будет достигнут желаемый момент времени дифференцировки. Затем зафиксируйте органоиды (см. раздел 5).
заметка: Иногда ткань может демонстрировать бутоны оптически полупрозрачной ткани без петлевых структур. Хотя это не идеально, это никак не влияет на развитие корковых структур. Органоиды можно культивировать в среде для дифференцировки органоидов в течение 40 дней. В течение более длительных периодов культивирования (40-100 дней) среда для дифференцировки органоидов может быть дополнена BME в масштабе 1:50 для увеличения сложности тканей, а также BDNF и GDNF для обеспечения выживания и созревания нейронов.