$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка материалов, необходимых для культивирования iPSC и дифференциации BEC.
- Матричное покрытие из пластика для культуры тканей (ТК) для культуры ИМР90-4 iPSC
- Аликвотный матричный гель базальной мембраны (например, Матригель) в аликвоты по 2,5 мг и хранить при температуре -20 °C.<бр/>
заметка: Работайте быстро при работе с матричным гелем и аликвотой на льду, так как он образует гель при температуре выше 4 °C и не может быть аликвотирован после застывания.
- Для нанесения покрытия на пластик TC быстро добавьте одну аликвоту матричного геля к 30 мл модифицированной среды Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 в конической пробирке объемом 50 мл. Добавьте 1 мл среды в застывший матричный гель, пипетируйте вверх и вниз, пока он не оттает, и немедленно переложите в коническую пробирку объемом 50 мл с оставшейся средой.
- Используйте 1 мл этого матричного гелеобразного раствора на лунку 6-луночного планшета и 12 мл на колбу T75.<бр/>
заметка: Матричный пластик ТС с гелевым покрытием может быть подготовлен за две недели до его использования. Тем не менее, очень важно избежать того, чтобы раствор матричного геля не высыхал, что может потребовать периодического добавления большего количества DMEM/F12 в верхнюю часть лунок.
- Приготовьте среду для поддержания стволовых клеток, добавив 50 мл добавки 50x к 450 мл базальной среды для поддержания стволовых клеток в стерильной среде шкафа биобезопасности.
- Для приготовления 500 мл некондиционированной среды (УМ) смешайте 392,5 мл DMEM/F12 со 100 мл нокаут-заменителя сыворотки (KOSR), 5 мл заменимых аминокислот, L-глутамином в конечной концентрации 1 мМ и 3,5 мкл β-меркаптоэтанола. Профильтровать-простерилизовать и хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
- Для приготовления 200 мл среды эндотелиальных клеток (ЭК) в сочетании с ретиноевой кислотой (РА) и bFGF смешайте 198 мл свободной среды эндотелиальной сыворотки крови человека (hESFM), 2 мл стерилизованной фильтром сыворотки с низким содержанием тромбоцитов (PDS) и 20 нг/мл bFGF. Фильтр простерилизовать и хранить до 2 недель при температуре 4 °C. Непосредственно перед добавлением в клетки добавьте 10 мкМ РА в среду EC.
заметка: Поскольку PDS была прекращена и, следовательно, может быть ограничена, этот протокол был успешно проведен с использованием B27 вместо PDS.
- Для приготовления 200 мл EC-среды без RA или bFGF соедините 198 мл hESFM и 2 мл фильтрующего стерилизованного PDS и стерилизуйте фильтром. Хранить до 4 недель при температуре 4 °C.
2. Дифференцировка эндотелиальных клеток мозга от иПСК человека
- Осаждение иПСК для дифференцировки (-3 день протокола дифференцировки)
- В соответствии с IMR90-4 поддерживающую культуру хорошо используют в планшете для дифференцировки, аспирируют питательную среду, добавляют 1 мл реагента для диссоциации ферментативных клеток в лунку и инкубируют при 37 °C в течение 7 мин.
- Инактивируйте реагент для ферментативной диссоциации клеток путем переноса 1 мл диссоциированной клеточной суспензии в коническую пробирку объемом 15 мл с конированием не менее 2 мл свежей среды для поддержания стволовых клеток на 1 мл клеток. Уменьшите клеточную суспензию при давлении 1 500 x g в течение 5 минут.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды для поддержания стволовых клеток на каждую лунку используемых клеток IMR90-4 и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра><.
заметка: Может быть полезно разбавить 1:1 0,4% трипанового синего, чтобы различать живые и мертвые клетки при подсчете. В зависимости от плотности ИПСК из одной лунки 6-луночного планшета обычно получается 1\u20122 x 106 ячеек.
- Для дифференцировки в колбе T75 добавьте 7,5 x 105 клеток к 12 мл среды для поддержания стволовых клеток и ингибитора ROCK (дигидрохлорид Y27632) в конечной концентрации 10 мкМ. Аспиматический матричный раствор гелеобразного покрытия из колбы T75 и перенесите клеточную суспензию в колбу. Распределите ячейки поровну, встряхивая колбу вперед и назад и слева направо, и инкубируйте при температуре 37 °C и 5% CO2,
заметка: На этом этапе крайне важно добавить ингибитор ROCK для повышения выживаемости диссоциированных одиночных стволовых клеток. Клетки должны быть равномерно распределены по колбе и в синглетах, демонстрируя распространенную, мезенхимальную морфологию из-за лечения ингибитором ROCK.
- На день -2 и -1 смените среду на свежую среду для поддержания стволовых клеток; 12 мл на Т75.
- В день 0 начните дифференцировку, сменив среду на UM; 12 мл на T75.
- Меняйте UM ежедневно (день 1 – день 5).
заметка: Клетки обычно достигают слияния через 2-3 дня в УМ, что можно наблюдать невооруженным глазом или через инвертированный светлопольный микроскоп. По мере прогрессирования дифференцировки «нервные тракты» nestin+ становятся видимыми с клетками PECAM-1+ между ними.
- Селективное расширение популяции эндотелиальных клеток путем перехода на среду EC с концентрацией 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ ретиноевой кислоты (RA) (6-й день) и инкубации в течение двух дней. Среду EC с bFGF можно готовить за две недели до этого. РА добавляется из замороженного сырья в день использования (например, 1 л 10 мМ РА на 1 мл EC + bFGF).
заметка: Успешная дифференцировка также может быть достигнута без добавок РА на 6 и 8 день. Однако пропуск RA приведет к образованию БЭК с пониженным TEER.
- Покрывайте планшеты для клеточных культур и мембранные вкладыши (например, Transwell) коллагеном IV и фибронектином (день 7) для очистки БЭК и последующих экспериментов.
- Для покрытия мембранных вставок смешайте 4 части коллагена внутривенно (1 мг/мл в 0,5 мг/мл уксусной кислоты), 1 часть фибронектина (1 мг/мл) и 5 частей стерильной тканевой воды. Раствор ECM можно разбавлять в соотношении 1:5 для покрытия планшетов для клеточных культур (т.е. 4 части коллагена внутривенно, 1 часть фибронектина, 45 частей воды). Инкубировать с раствором для нанесения покрытия при температуре 37 °C в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины и мембранные вставки также могут быть покрыты не менее чем за 4 часа до субкультивирования в тот же день этапа очистки.
- Очистите БЭК путем субкультивирования дифференцированных клеток на коллагеновых IV и покрытых фибронектином пластинах или мембранных вставках (день 8).
- Аспиратуйте среду EC и добавьте реагент для ферментативной диссоциации клеток (12 мл на Т75). Инкубировать при 37 °C до тех пор, пока 90% клеток не отделятся от колбы.
заметка: Диссоциация клеток может занять до 1 ч.
- Во время инкубации удалите раствор коллагена IV/фибронектинового покрытия с ранее подготовленных планшетов/вкладышей и дайте им высохнуть в стерильном колпаке. Сушка вкладышей занимает около 20 минут.
- После того, как клетки отсоединились, смойте их с колбы с помощью пипетки объемом 10 мл. Проводите пипеткой вверх и вниз для получения суспензии за одну клетку.
заметка: Суспензия одиночных клеток важна для надежного подсчета клеток и получения твердых монослоев.
- Разведите по меньшей мере равным объемом свежего hESFM в конической пробирке объемом 50 мл и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Гранулируйте ячейки при 1 500 x g в течение 10 минут.
- Ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме свежеприготовленными EC + bFGF + RA для получения суспензии 2 x 106 клеток/мл для посева на мембранные вставки. Добавьте 500 мкл (1 x 106 ячеек) в верхнюю часть 12-луночного вкладыша и 1,5 мл среды EC + bFGF + RA на дно. Для затравки на 24 и 48-луночные планшеты разбавить клеточную суспензию в соотношении 1:2 и добавить 500 мкл (5 х 105 ячеек) и 250 мкл (2,5 х10 5 ячеек) в лунку соответственно. Равномерно распределите клетки по лунке/вставке и инкубируйте при 37 °C при 5%CO2.
- Замените среду на планшетах/трансвеллах на EC без bFGF или RA (день 9).