Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Выделение стромально-васкулярной фракции (SVF)
Соберите жировую ткань периаортальной дуги (PAAT) 5-6 мышей в одну микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 1 мл свежеприготовленной среды для пищеварения, и измельчите ткань хирургическими ножницами в пробирке Эппендорфа при комнатной температуре (RT).
- Переложите смесь в пробирки объемом 50 мл, содержащие 9 мл среды для сбраживания. Гомогенизируйте ткани путем пипетирования вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1 мл 10 раз.
- Инкубируйте пробирки при температуре 37 °C с постоянным встряхиванием при 100 об/мин в течение 30–45 минут и проверяйте каждые 5–10 минут, чтобы предотвратить переваривание. Это имеет решающее значение для повышения жизнеспособности клеток и урожайности.
заметка: Хорошее переваривание тканей приведет к образованию однородной, светло-желтой жировой ткани, которая будет видна невооруженным глазом при осторожном вращении трубки.
- Остановите разложение, добавив 5 мл HDMEM, содержащего 10% FBS и 1% v/v PS при RT, и хорошо перемешайте с помощью пипетирования.
- Центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 500 x g в течение 5 мин при RT. SVF будет виден как коричневатая гранула. Осторожно аспирируйте плавающие адипоциты и сцедите оставшуюся надосадочную жидкость, не нарушая SVF. Растворите гранулу SVF в 10 мл питательной среды и отфильтруйте через сетчатое фильтр 70 мкм.
- Центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 500 x g в течение 5 мин, удалите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте гранулу в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов в конической пробирке объемом 15 мл в течение 10 мин при ЛТ.
- Остановите реакцию, добавив 10 мл 1x PBS, содержащего 1% FBS. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл 1x PBS, содержащей 1% FBS.
- Снова центрифугируйте клетки при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл питательной среды в конической пробирке объемом 15 мл при 4 °C.
- После заключительного раунда центрифугирования (500 x g в течение 5 мин при 4 °C) повторно суспендируйте гранулированные клетки в 5 мл буфера FACS (PBS, содержащего 10% FBS, 100 единиц/мл ДНК I и 1% v/v PS) на льду и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
2. Изоляция NCADSC с помощью FACS
- Настройте и оптимизируйте сортировщик ячеек, следуя инструкции по эксплуатации. Выберите сопло 100 μм, простерилизуйте сборные трубки, установите необходимое сборное устройство и настройте боковые потоки.
- Для сортировки ячеек RFP+ рекомендуется использовать желтый/зеленый лазер с длиной волны 561 нм и оптический фильтр 579/16. Выполните компенсацию с помощью отрицательного контроля и положительного контроля с одинарным окрашиванием. Схема стробирования приведена на рисунке 1А.
- Фильтруйте клетки через ситечко 40 мкм, центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин и ресуспендируйте их в 2 мл буфера FACS с плотностью 0,5–1 x 107/мл. Переложите ячейки в четко промаркированные полистирольные пробирки объемом 5 мл с круглым дном и загрузите их в сортировщик.
- Проведите пробирку с экспериментальным образцом при температуре 4 °C, включите отклоняющие пластины и отсортируйте в коническую пробирку объемом 15 мл, предварительно покрытую RPMI, содержащим 1% FBS и 1% v/v PS.
заметка: Защищайте образцы от яркого света, чтобы свести к минимуму гашение RFP.
3. Культура NCADSC
- Отсортированные клетки тарелируют с плотностью 5000 клеток/см2 в 12-луночном культуральном планшете в полной питательной среде и инкубируют при 37°С во влажной атмосфере с 5%СО2 в течение 20–24 ч.
- Удалите питательную среду, промойте клетки предварительно подогретым (37 °C) PBS для удаления клеточного мусора и добавьте свежую питательную среду.
