Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Получение стерильных растворов поли-D-лизина (PDL) и ламинина
- Не менее чем за сутки до выделения клеток приготовьте поли-D-лизин (PDL) и пластины, покрытые ламинином.
заметка: В зависимости от целей эксперимента готовили как 6-луночные, так и 12-луночные планшеты. Как правило, для количественного анализа с использованием вестерн-блотов использовали 12-луночные планшеты, а для проведения автоклавных (стерильных) покровных стекол для иммуногистохимии — 6-луночные планшеты. Для культивирования кишечных глиальных клеток (EGC) для визуализации потока Ca2+ использовали 24-луночные планшеты.
- Разбавляйте исходные растворы водой со сверхчистой водой для тканевых культур, без ДНКазы и РНКазы в вытяжке для тканевых культур с воздухом, отфильтрованным HEPA.
- Стерилизующие покровные стекла
- Держите покровный лист стерильными щипцами и погрузите покровный лист в стакан со 100% этанолом на 15 мин. Дайте этанолу испариться в капюшоне для культуры тканей, а затем поместите его в 6-луночные планшеты.
- В качестве альтернативы можно поместить несколько покровных стекол по отдельности на промокательную бумагу толщиной 2 мм в пластиковый контейнер, а затем провести автоклав.
2. Покрытие пластин
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги под колпаком для ламинарного потока стерильной культуры тканей.
- Разморозьте 1 мг/мл PDL и разбавьте 1:10 стерильной водой для тканевых культур до конечной концентрации 100 мкг/мл. Используйте 2 мл на лунку для покрытия 6-луночных планшетов, 1 мл для покрытия одной лунки 12-луночного планшета и 0,5 мл для одной лунки в 24-луночных планшетах. Оставшийся разведенный PDL хранить в 12 мл аликвот при температуре -20 °C.
- Дав PDL покрыть лунки в течение не менее 1 часа, удалите PDL стерильной пипеткой. Дайте планшетам полностью высохнуть на воздухе под ламинарным вытяжным шкафом для культуры тканей.
заметка: После удаления раствора PDL стерильной пипеткой его можно использовать еще дважды в течение 1 недели после прохождения через фильтр 0,22 мкм и хранения при температуре 4 °C.
- Разморозьте запас ламинина на льду, чтобы избежать образования геля.
заметка: Неразбавленный ламинин становится твердым при нагревании выше 8 °C.
- Разбавьте запас ламинина (0,5 мг/мл) в соотношении 1:50 стерильным фосфатным солевым буфером Дульбекко (DPBS) до получения конечной концентрации 10 мкг/мл. Разведенный ламинин хранить в 12 мл аликвот при температуре -20 °С.
- Добавьте разведенный ламинин в лунки, содержащие высушенный PDL. Используйте 1 мл для покрытия поверхности 6 лунок и 0,5 мл для покрытия дна 12-луночных планшетов. Для покровных стекол добавьте 400 μл разбавленного ламинина в покровные стекла для достижения покрытия поверхности.
- Инкубируйте пластины с покрытием при температуре 37 °C в течение 2 часов, если планшет используется в тот же день (быстрое покрытие). Если нет, запечатайте пластины полиэтиленовой пленкой и храните их в течение ночи при температуре 4 °C (медленное покрытие).
заметка: Герметизация имеет решающее значение для предотвращения высыхания и загрязнения.
- Аккуратно удалите раствор ламинина с помощью пипетки, чтобы не поцарапать поверхность. Аккуратно промойте лунки три раза стерильным DPBS.
- Добавьте полную глиальную питательную среду в каждую лунку и поддерживайте температуру в пластинах при температуре 37 °C до тех пор, пока не будете готовы добавить суспензию EГC.
заметка: Пластины, покрытые поли-D лизином и ламинином, можно хранить в течение 3 дней при температуре 4 °C. Покройте пластины на несколько дней вперед, а затем храните при 4 °C; Вымойте пластины стерильным фосфатным буферным раствором Дульбекко (DPBS) три раза. Добавьте по 2 мл стерильного DPBS в каждую лунку после окончательного мытья. Запечатайте пластину парапленкой и храните при температуре 4 °C. Важно следить за тем, чтобы ламинин не пересыхал.
3. Приготовление изоляционных растворов
- Приготовьте раствор для диссоциации EDTA/HEPES/DPBS. На 500 мл раствора используют стерильные DPBS (без кальция и магния) для приготовления окончательного раствора из 10 мМ HEPES и 5 мМ ЭДТА. К 490 мл DPBS добавьте 5 мл 1 М буфера HEPES и 5 мл 0,5 М стокового раствора ЭДТА. Хранить при температуре 4 °C до использования.
- Приготовьте среду для ресуспензии глиальных клеток с использованием реагентов, перечисленных в таблице 1.
- Готовят глиальные питательные среды с использованием реагентов, перечисленных в таблице 2.
заметка: Глиальная питательная среда, содержащая GDNF, может храниться в течение одной недели при температуре 4 °C.
4. Удаление кишечного сегмента
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышам был разрешен свободный доступ к пище и воде до эвтаназии методом капель изофлурана и удаления жизненно важного органа. Использовали мышей C57BL/6 в возрасте старше 8 недель. Оба пола использовались без заметных различий в подготовке.
- Усыпьте мышь с помощью передозировки изофлурана и поместите ее лежа на спине в лоток для препарирования. Приколите конечности и простерилизуйте брюшную полость 70% этанолом. Наложите на кожу щипцы, а затем вскройте живот ножницами.
- Поднимите печень и определите дистальный отдел желудка/привратник. Затем удалите 7 см проксимального отдела кишки. Будьте осторожны, чтобы не порвать кишечник.
- Удерживайте привратник щипцами, одновременно отрезая брыжейку.
- Используйте тупое рассечение тыльной стороной ножниц, чтобы соскоблить приросшую поджелудочную железу.
- Поместите кишечный сегмент в ледяную DPBS без Ca2+ или Mg2+ (рис. 1A).
заметка: Другие сегменты кишечника или толстой кишки также могут быть удалены с помощью той же техники.
- С помощью шприца объемом 5 или 10 мл, прикрепленного к тупой игле 20 G, вымывайте содержимое кала с помощью ледяного DPBS (рисунок 1B).
- Разделите кишечник на сегменты по 3 см, чтобы удалить продольную мышцу. ПРИМЕЧАНИЕ: Кишечные сегменты до двух мышей используются на 30 мл изоляционного раствора HEPES/EDTA/DPBS.
- Отломите примерно 4 см, чтобы отделить деревянную палочку от ватного кончика. Замочите деревянную палочку в DPBS (рисунок 1C).
- Плавно наденьте один из кишечных сегментов на смоченную палочку (рисунок 2A-C).
- Удалите прилипшую брыжейку, которая все еще прикреплена, с помощью игольчатых щипцов (рисунок 2D).
- С помощью чистого бритвенного лезвия или скальпеля сделайте два продольных зазубрины вдоль кишечника, где была прикреплена брыжейка (рисунок 2E).
- Смочите ватный наконечник с помощью DPBS. Разотрите смоченный ватный кончик в продольном направлении вдоль мышцы, чтобы ослабить продольное мышечное/миентеральное сплетение (LMMP). Затем переместите ватный кончик горизонтально, чтобы отделить LMMP от круговой мышцы по длине кишечного сегмента во время удаления LMMP.
- Держите кончик палочки между большим и указательным пальцами, одновременно стабилизируя сегмент средним и четвертым пальцами (рисунок 2F). По завершении LMMP легко отслаивается от кишечного сегмента.
- Выбросьте LMMP, извлеченный из кишечной трубки и прикрепленный к ватному тампону, если не требуется забор EGC из миентерального сплетения.
- С помощью бритвенного лезвия вскройте кишечный сегмент в продольном направлении, чтобы извлечь из него деревянную палочку.
- Храните очищенную кишечную ткань (преимущественно слизистую и подслизистую оболочку плюс круговые мышцы) в DPBS на льду. Повторяйте шаги 4.4–4.11 до тех пор, пока не будут подготовлены все сегменты кишечника.
5. Удаление слизистой оболочки эпителия
- Разрежьте кишки на более мелкие кусочки ~0,5 см тонкими ножницами.
- Поместите салфетку в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 30 мл ледяного раствора EDTA/HEPES/DPBS.
- Раскачивайте тканесодержащий раствор при температуре 4 °C в течение 10 мин со скоростью ~60 наклонов в минуту.
- Предварительно смочите пластиковую пипетку объемом 5 мл, пипетируя буфер EDTA/HEPES/DPBS вверх и вниз один раз, а затем используйте предварительно увлажненную пипетку для пипетирования ткани и буферной суспензии вверх и вниз (растирание) 20 раз, чтобы сместить слизистую оболочку эпителия.
- Соберите ткань из инкубации ЭДТА, вылив смесь через нейлоновое сетчатое фильтр размером 100 мкм. Откажитесь от мутного протока, наполненного слизистой (рисунок 3).
- Поместите ткань, оставшуюся в ситечке, в новую коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 30 мл ледяного холода EDTA/HEPES/DPBS, с помощью игольчатых щипцов.
- Повторите инкубацию EDTA/HEPES/DPBS во второй раз, покачивая ткань при температуре 4 °C в течение 10 минут со скоростью ~60 наклонов в минуту, чтобы удалить дополнительную слизистую оболочку эпителия.
- Предварительно смочите пипетку объемом 5 мл с буфером, а затем 20 раз накачайте тканевую суспензию вверх и вниз, чтобы вытеснить клетки слизистой.
заметка: Ткань будет иметь тенденцию прилипать к внутренней части пипетки по мере удаления большей части эпителия.
- Соберите ткань после второй инкубации, вылив смесь через нейлоновое сетчатое ситечко размером 100 мкм, и выбросьте поток. Второй проточный поток должен быть заметно менее мутным, чем первый (рисунок 3).
- Повторяйте 10-минутную инкубацию ЭДТА до тех пор, пока раствор не станет почти прозрачным (примерно от 3 до 4 инкубаций в зависимости от количества ткани и эффективности растирания) (Рисунок 3).
6. Коллекция кишечных глиальных клеток из собственной и подслизистой пластинки
- Перенесите ткань из нейлонового фильтра в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл коммерчески доступного раствора для восстановления клеток, и покачивайте в течение 25–30 минут при 4 °C.
- Слегка растирайте 10 раз, чтобы диссоциировать кишечные глиальные клетки от собственной пластинки.
- Профильтруйте через фильтр 40 μм и соберите фильтрат в чистую пробирку объемом 50 мл.
- Промойте салфетку на нейлоновом фильтре 1 мл DPBS.
- Выбросьте салфетку и перенесите ~5–6 мл фильтрата в чистую коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Вращайте фильтрат при давлении 2 000 x g в центрифуге с качающимся ведром в течение 5 минут при температуре 4 °C.
- Повторно суспендируйте гранулу, содержащую глиальные клетки, по меньшей мере в 1 мл буфера для ресуспензии, осторожно пипетируя гранулу вверх и вниз с помощью наконечника пипетки объемом 500 мкл. Избегайте появления пузырей.
заметка: При необходимости отрегулируйте объем ресуспензии в соответствии с количеством лунок и планшетов. Например, 1,2 мл для одного 6-луночного планшета, 2,4 мл для двух 6-луночных планшетов, 2,4 мл для одного 12-луночного планшета.
- Пипетку 200 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 6-луночного или 100 мкл для 12-луночных пластин, покрытых PDL-ламинином, содержащих глиальную питательную среду.
- Не тревожьте посуду после добавления клеток в тарелки и помещения в инкубатор при температуре 37 °C, чтобы обеспечить прилипание максимального количества клеток.
заметка: Здоровый препарат клеток прикрепляется в течение 6–8 часов, но подождите не менее 24 часов, прежде чем менять среду, осторожно отпиливая среду вместе с неадгезивными клетками.
- Используйте клетки для экспериментов через 3–4 дня после их помещения в культуру (рис. 4).
Таблица 1. Состав среды для ресуспензии глиальных клеток.
| Компоненты | Объем к добавлению | Окончательная концентрация |
| DMEM/F12 | 44,5 мл | _ |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | 5 мл | 10% |
| Пенициллин-стрептомицин | 500 мкл | Ручка 100 МЕ/мл |
| стрептомицин | | 100 мкг/мл стрептококка |
| Гентамицин (50 мг/мл в запасе) | 20 μл | 20 мкг/мл |
Таблица 2. Состав питательных сред глиальных клеток
| Компоненты | Объем к добавлению | Окончательная концентрация |
| DMEM/F12 | 44 мл | _ |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | 5 мл | 10% |
| Пенициллин-стрептомицин (100x) | 500μл | 100 МЕ/мл (ручка) |
| 100 мкг/мл (стрептококк) | | |
| Гентамицин (50 мг/мл в запасе) | 20 μл | 20 мкг/мл |
| GDNF (10 г/мл склада) | 50 μл | 10 нг/мл |
